Los efectos del consumo de un mes de extracto estandarizado de aronia melanocarpa sobre la anemia en pacientes en hemodiálisis

Evaluación del estado redox sistémico Las muestras de plasma se utilizaron para determinar los niveles de los siguientes prooxidantes: radical anión superóxido (O2-), peróxido de hidrógeno (H2O2), nitritos (NO2-) e índice de peroxidación lipídica medido como ácido tiobarbitúrico reactivo (TBARS), mientras que los parámetros del sistema de defensa antioxidante, como las actividades de superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) y el nivel de glutatión reducido (GSH) se determinaron en muestras de lisados ​​de eritrocitos.

A) Determinación del índice de peroxidación lipídica (TBARS) El grado de peroxidación lipídica en las muestras de plasma se estimó midiendo TBARS, utilizando ácido tiobarbitúrico al 1% en NaOH 0,05, que se incubó con la muestra a 100 °C durante 15 min y se midió a 530 nm. El extracto de TBA se obtuvo combinando 0,8 ml de muestra y 0,4 ml de ácido tricloroacético (TCA); posteriormente, las muestras se colocaron en hielo durante 10 min y se centrifugaron durante 15 min a 6000 rpm. (1).

b) Determinación de nitritos (NO2-)

El óxido nítrico (NO) se descompone rápidamente para formar productos estables de nitrito/nitrato. Se midió el nivel de NO2 y se usó como índice de producción de NO, usando el reactivo de Griess. Para la determinación de NO2 en plasma, se pusieron en hielo 0,1 ml de PCA 3 N (ácido percloruro), 0,4 ml de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 20 mM y 0,2 ml de plasma durante 15 min, luego se centrifugaron durante 15 min a 6000 rpm. Después de verter el sobrenadante, se añadieron 220 μl de K2CO3. Los nitritos se midieron a 550 nm. (2)

1. Determinación del radical anión superóxido (O2-)

   Las concentraciones de radicales de anión superóxido en muestras de plasma se midieron utilizando el reactivo NTB (Nitro Blue Tetrazolium) en tampón TRIS (mezcla de ensayo). La medición se realizó a una longitud de onda de 530 nm. (3).

2. Determinación de peróxido de hidrógeno (H2O2)

   La medición de H2O2 se basó en la oxidación del rojo de fenol por H2O2 en una reacción catalizada por peroxidasa de rábano picante. Se precipitaron 200 microlitros de perfusión o plasma utilizando 800 ml de solución de rojo de fenol recién preparada; Posteriormente se añadieron 10 μL de peroxidasa de rábano picante (1:20) (preparada inmediatamente antes de su uso). El nivel de H2O2 se midió a 610 nm (4).

3. Determinación de glutatión reducido (GSH)

   El nivel de glutatión reducido (GSH) se determinó en base a la oxidación de GSH a través del ácido 5,5-ditiobis-6,2-nitrobenzoico. El extracto de GSH se obtuvo combinando 0,1 ml de EDTA al 0,1 %, 400 μl de hemolizado y 750 μl de solución de precipitación (que contenía 1,67 g de ácido metafosfórico, 0,2 g de EDTA, 30 g de NaCl, y se llenó con agua destilada hasta 100 ml; la solución es estable durante 3 semanas a +4C°). El nivel de GSH se midió a 420 nm (5).

4. Determinación de enzimas antioxidantes (SOD, CAT)

Los glóbulos rojos aislados se lavaron tres veces con tres volúmenes de NaCl 0,9 mmol/l enfriado con hielo, y se usaron hemolizados que contenían aproximadamente 50 g Hb/l para la determinación de la actividad CAT. Se usaron tampón CAT, muestra de hemolizado preparado y H2O2 10 mM para la determinación de CAT. La detección se realizó a 360 nm. La actividad de SOD se determinó por el método de la epinefrina. El hemolizado se mezcló con tampón de carbonato y luego se agregó epinefrina. La detección se realizó a 470 nm (6-10).

Evaluación del estado inflamatorio Para evaluar el estado inflamatorio de los pacientes, se midieron los siguientes parámetros en ambos puntos de interés (día 0 y 30): concentración de proteína C reactiva en suero - PCR y concentración de factor de necrosis tumoral - TNF-α.

La concentración sérica de proteína C reactiva (PCR) se determinó mediante el método turbidimétrico en el Olympus AU680. La concentración sérica normal de CRP es ≤ 5 mg/L. La microinflamación se define como la concentración de PCR en el suero de 5 mg/L.

Las concentraciones plasmáticas de TNF-α se determinaron mediante un ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA) utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas tipo sándwich indirecto de alta sensibilidad comercialmente disponible (Sigma Aldrich).

Evaluación de los parámetros hematológicos

En ambos puntos de interés se analizaron los valores de los siguientes parámetros hematológicos en todos los pacientes:

Eritrocitos (Er), hemoglobina (Hb), hematocrito (Hct), índice de eritrocitos-volumen corpuscular medio (MCV), hemoglobina corpuscular media (MCH), concentración de hemoglobina corpuscular media (MCHC), concentración de lactato deshidrogenasa sérica (LDH), haptoglobina sérica concentración y estado del hierro: concentración sérica de hierro, ferritina; capacidad de unión de hierro total (TIBC), capacidad de unión de hierro insaturado (UIBC), saturación de transferrina (TSAT), haptoglobina.