Una evaluación integral del ADN tumoral circulante y las células tumorales circulantes como marcador predictivo en el cáncer de pulmón

El cáncer de pulmón no solo se encuentra entre los 3 tipos de cáncer más comunes tanto en hombres como en mujeres, sino que también es la principal causa de mortalidad por cáncer en Singapur y los Estados Unidos. La quimioterapia basada en platino es actualmente el pilar en el tratamiento farmacológico de los pacientes con cáncer de pulmón, aunque solo alivia temporalmente los síntomas relacionados con la enfermedad. Recientemente, el uso de terapia dirigida molecularmente ha llevado a mejorar la supervivencia en subgrupos de pacientes. En particular, la presencia de mutaciones de EGFR o ALK en biopsias de pulmón predice una tasa de respuesta mejorada y una supervivencia libre de progresión con el uso de inhibidores de la tirosina cinasa o crizotinib, respectivamente. Es importante destacar que las mutaciones de EGFR son más comunes en tumores de pacientes asiáticos (alrededor del 35 %) en comparación con los no asiáticos (alrededor del 10 %).

La principal causa de mortalidad en pacientes con cánceres sólidos son las metástasis por diseminación a través de la circulación sanguínea. La capacidad de detectar la presencia de células tumorales en circulación incluso antes de que se produzcan metástasis evidentes ha evolucionado rápidamente en los últimos años. Se ha descubierto la importancia pronóstica del ADN tumoral circulante (ctDNA) y las células tumorales circulantes (CTC) en varios tipos de cáncer y se reconoce ampliamente que esta técnica tiene una gran importancia clínica y biológica. Este estudio evalúa el uso de ctDNA y CTC para predecir la actividad de la enfermedad y la respuesta a los medicamentos en pacientes con cáncer de pulmón y sirve para complementar los métodos existentes para lograr un medio no invasivo y preciso para guiar las decisiones de tratamiento.

De hecho, el uso de ctDNA y CTC como marcador para la evaluación de riesgos y el control del tratamiento es ventajoso, ya que es accesible y puede controlarse periódicamente de forma no invasiva. Esto adaptará mejor nuestros programas de vigilancia y tratamiento para optimizar los resultados de la enfermedad.

Los investigadores han desarrollado un kit de detección de mutaciones de EGFR que detecta las 3 mutaciones principales de EGFR a niveles ultrasensibles. Los investigadores han aplicado esto a una variedad de materiales clínicos que incluyen ADN embebido en parafina fijado con formalina, derrames pleurales, ADN circulante y células tumorales circulantes y descubrieron que los kits pueden detectar estas mutaciones con alta sensibilidad y especificidad.

El Instituto de Bioingeniería y Nanotecnología ha desarrollado un dispositivo de filtro de membrana de microtamiz para aislar eficazmente las células tumorales circulantes de una muestra de sangre completa. El dispositivo aprovecha la diferencia de tamaño entre las células cancerosas y las células sanguíneas para lograr la captura de células cancerosas en un filtro de microtamiz con una tasa de recuperación > 85 % a partir de 4,5 ml de sangre completa en 10 minutos, demostrada con células cancerosas añadidas a muestras de sangre completa. El dispositivo contiene una matriz de poros densamente empaquetada (> 8000 poros/mm^2) con un diámetro de poro optimizado de 10 µm. La regulación de fluidos y el recuento de células se logran mediante un simple bombeo de vacío y un microscopio de fluorescencia de laboratorio. Las células capturadas se tiñen con anti-EpCAM-PE para CTC, anti-CD45-FITC para glóbulos blancos y 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para núcleos celulares. Las CTC se identifican con anti-EpCAM positivo, anti-CD45 negativo y DAPI positivo, caracterizados mediante un microscopio de fluorescencia.

Por lo tanto, a partir de nuestros estudios preliminares, los investigadores plantean la hipótesis de que nuestra tecnología es útil para aislar las células tumorales circulantes y que estas células tumorales circulantes probablemente se correlacionen con la actividad de la enfermedad y no se encuentren en individuos sanos.

La monitorización del ADN tumoral circulante y de las células tumorales circulantes puede proporcionar un tiempo de anticipación clínicamente valioso para determinar la respuesta, en comparación con los métodos radiológicos convencionales.

Se reclutará una cohorte de pacientes para un estudio de cohorte longitudinal donde se recolectan tejidos y sangre para biomarcadores. No se prevé ninguna intervención. El estudio se llevará a cabo durante tres años.

Muestras de pacientes y consentimiento

Prospectivamente durante seis años (agosto de 2014 a agosto de 2020), se recolectarán tumores y/o sangre y/o derrames a unos 150 pacientes diagnosticados con cáncer de pulmón que den su consentimiento informado completo para este estudio. Los pacientes de otros lugares pueden ser referidos a estos sitios.

Si los pacientes no dan su consentimiento para la extracción de sangre para estudios clínicos, pero han dado su consentimiento y han firmado un consentimiento operativo informado para la extracción de material congelado o fijado en formalina incluido en parafina con fines de investigación, incluidas biopsias, citologías o resecciones quirúrgicas como parte del formulario de consentimiento quirúrgico estándar, El tejido tumoral y el tejido normal se recolectarán del Hospital General de Changi. La estadificación y la clasificación del tumor se obtuvieron a partir de la revisión de los informes patológicos y la evaluación de las notas del caso por parte de investigadores clínicos individuales. Se obtendrá de todos los pacientes un consentimiento informado por escrito para el análisis de muestras clínicas recolectadas prospectivamente, incluido el consentimiento para obtener una muestra de tejido pulmonar para biopsia con fines de investigación. No se necesitan otros procedimientos adicionales además del procedimiento recomendado para extraer el tejido del paciente para la evaluación del tumor, ya sea broncoscopia, biopsia guiada por TC o cirugía abierta, según la evaluación del médico. Una vez que se complete el procedimiento de rutina, se seleccionará uno de los tejidos para fines de investigación. Los "bloques de tejido de investigación" se anonimizarán y los portaobjetos se agruparán para su posterior examen/verificación de la presencia del tumor por parte de un patólogo.

Cada posible paciente proporcionará 3 tubos de sangre con EDTA de referencia (un total aproximado de 30 ml). La orina (~100 ml) se recolectará al mismo tiempo para el estudio del ADN de la orina.

Estas muestras de sangre se centrifugarán durante 10 minutos a 3000 rpm, para la recolección de suero y plasma para la validación de biomarcadores identificados por análisis de micromatrices, seleccionando proteínas candidatas secretadas en la sangre.

Los derrames (pleurales o peritoneales) se obtendrán como parte de los procedimientos terapéuticos de rutina según lo recomiende el médico tratante, donde los líquidos de otro modo se habrían desechado. En ningún momento se obtendrá líquido de efusión con el único propósito de este estudio.

Se realizarán trabajos posteriores en términos de evaluación de las CTC, células mononucleares de sangre periférica, ADN, ARN, proteínas y otros materiales genéticos y moleculares. Las técnicas aplicadas incluirán PCR cuantitativa, secuenciación, citometría de flujo e inmunofenotipado, inmunohistoquímica, hibridación fluorescente in situ, cultivo, etc.

Análisis mutacional:

El material genético se extraerá de 3-5 mL de materiales atrapados en el tamiz y del plasma sanguíneo, así como material relevante como efusiones u orina. Esto se analizará mediante PCR cuantitativa utilizando cebadores y/o secuenciación diseñados a medida. Los materiales genéticos también se perfilarán utilizando técnicas de secuenciación de próxima generación para identificar mutaciones procesables clínicamente como BRAF, ALK, ROS, RET, etc.

Las muestras se procesarán frescas. Cualquier muestra restante se separará en capas leucocitarias y plasma y se almacenará en nitrógeno líquido y/o -80C.

Los datos y las muestras se desidentifican para su procesamiento en laboratorio. Cada sitio conservará la información que vincula al paciente con la muestra. Esto es necesario para la determinación del seguimiento.

Los datos identificados se ubicarán en una PC en red, ubicada físicamente en el Hospital General de Changi y detrás de firewalls institucionales. Los datos de identificación individual se conservarán en el hospital y no se compartirán con el laboratorio.

Los datos se archivarán para proyectos posteriores una vez que se complete el estudio.