Kompleksowa ocena krążącego DNA nowotworu i krążących komórek nowotworowych jako markera predykcyjnego w raku płuca

Rak płuc jest nie tylko jednym z trzech najczęstszych rodzajów raka u mężczyzn i kobiet, ale także główną przyczyną śmiertelności z powodu raka w Singapurze i Stanach Zjednoczonych. Chemioterapia oparta na platynie jest obecnie podstawą leczenia farmakologicznego pacjentów z rakiem płuc, chociaż łagodzi objawy związane z chorobą tylko tymczasowo. Ostatnio zastosowanie terapii ukierunkowanej molekularnie doprowadziło do poprawy przeżywalności w podgrupach pacjentów. W szczególności obecność mutacji EGFR lub ALK z biopsji płuc przewiduje poprawę wskaźnika odpowiedzi i przeżycie wolne od progresji choroby po zastosowaniu odpowiednio inhibitorów kinazy tyrozynowej lub kryzotynibu. Co ważne, mutacje EGFR częściej występują w nowotworach pacjentów pochodzenia azjatyckiego (około 35%) w porównaniu z pacjentami niebędącymi Azjatami (około 10%).

Główną przyczyną śmiertelności pacjentów z nowotworami litymi są przerzuty z rozsiewu poprzez krążenie krwi. Zdolność do wykrywania obecności komórek nowotworowych w krążeniu, nawet zanim pojawią się jawne przerzuty, szybko ewoluowała w ostatnich latach. Stwierdzono znaczenie prognostyczne krążącego DNA guza (ctDNA) i krążących komórek nowotworowych (CTC) w kilku nowotworach, a technika ta jest powszechnie uznawana za mającą duże znaczenie kliniczne i biologiczne. Niniejsze badanie ocenia zastosowanie ctDNA i CTC w przewidywaniu aktywności choroby i odpowiedzi na lek u pacjentów z rakiem płuc i służy uzupełnieniu istniejących metod w celu uzyskania nieinwazyjnych i dokładnych środków do kierowania decyzjami terapeutycznymi.

Rzeczywiście, wykorzystanie ctDNA i CTC jako markera do oceny ryzyka i monitorowania leczenia jest korzystne, ponieważ jest dostępne i może być regularnie monitorowane w sposób nieinwazyjny. Pozwoli to lepiej dostosować nasze programy nadzoru i leczenia w celu optymalizacji wyników leczenia.

Badacze opracowali zestaw do wykrywania mutacji EGFR, który wykrywa 3 główne mutacje EGFR na ultraczułych poziomach. Badacze zastosowali to do różnych materiałów klinicznych, w tym utrwalonego w formalinie DNA zatopionego w parafinie, wysięku opłucnowego, krążącego DNA, jak również krążących komórek nowotworowych i stwierdzili, że zestawy mogą wykrywać te mutacje z dużą czułością i specyficznością.

W Instytucie Bioinżynierii i Nanotechnologii opracowano mikrositowe urządzenie filtrujące membranowe do skutecznego izolowania krążących komórek nowotworowych z próbki krwi pełnej. Urządzenie wykorzystuje różnicę wielkości między komórkami nowotworowymi a komórkami krwi, aby uzyskać wychwytywanie komórek nowotworowych na filtrze mikrositowym z > 85% współczynnikiem odzysku z 4,5 ml krwi pełnej w ciągu 10 minut, co wykazano na komórkach nowotworowych wprowadzonych do próbek krwi pełnej. Urządzenie zawiera gęsto upakowany układ porów (> 8000 porów/mm^2) o zoptymalizowanej średnicy porów 10 µm. Regulację płynów i liczenie komórek uzyskuje się za pomocą prostego pompowania próżniowego i laboratoryjnego mikroskopu fluorescencyjnego. Wychwycone komórki są barwione anty-EpCAM-PE dla CTC, anty-CD45-FITC dla białych krwinek i 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) dla jąder komórkowych. CTC identyfikuje się jako anty-EpCAM-pozytywne, anty-CD45-ujemne i DAPI-pozytywne, scharakteryzowane przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.

Dlatego na podstawie naszych wstępnych badań badacze wysuwają hipotezę, że nasza technologia jest przydatna do izolowania krążących komórek nowotworowych i że te krążące komórki nowotworowe prawdopodobnie korelują z aktywnością choroby i nie występują u osób zdrowych.

Monitorowanie krążącego DNA nowotworu i krążących komórek nowotworowych może zapewnić klinicznie cenny czas realizacji w określaniu odpowiedzi, w porównaniu z konwencjonalnymi metodami radiologicznymi.

Kohorta pacjentów zostanie zrekrutowana do podłużnego badania kohortowego, w którym pobierane będą tkanki i krew w celu uzyskania biomarkerów. Nie przewiduje się żadnej interwencji. Badanie będzie prowadzone przez trzy lata.

Próbki pacjentów i zgoda

W perspektywie sześciu lat (od sierpnia 2014 do sierpnia 2020) około 150 pacjentów ze zdiagnozowanym rakiem płuc, którzy wyrażą pełną świadomą zgodę na to badanie, będzie miało pobrany guz i/lub krew i/lub wysięk. Pacjenci z innych lokalizacji mogą być kierowani do tych witryn.

Jeżeli pacjenci nie wyrażają zgody na pobranie krwi do badań klinicznych, ale wyrazili zgodę i podpisali świadomą zgodę operacyjną na pobranie zamrożonego lub utrwalonego w formalinie materiału parafinowego do celów badawczych, w tym biopsji, cytologii lub resekcji chirurgicznych w ramach standardowego formularza zgody chirurgicznej, tkanka nowotworowa i tkanka prawidłowa zostaną pobrane ze szpitala Changi General Hospital. Stopniowanie i klasyfikację guza uzyskano na podstawie przeglądu raportów patologicznych i oceny notatek dotyczących przypadków przez poszczególnych klinicystów. Od wszystkich pacjentów zostanie uzyskana pisemna świadoma zgoda na analizę pobranych prospektywnie próbek klinicznych, w tym zgodę na pobranie wycinka tkanki płuca do celów badawczych. Żadne inne dodatkowe procedury nie są potrzebne poza zalecaną procedurą usunięcia tkanki pacjenta w celu oceny guza, czy to bronchoskopią, biopsją pod kontrolą tomografii komputerowej, czy otwartą operacją, w zależności od oceny lekarza. Po zakończeniu rutynowej procedury jedna z tkanek zostanie wybrana do badań. „Bloki tkanki badawczej” zostaną zanonimizowane, a preparaty podzielone na partie w celu późniejszego zbadania/weryfikacji obecności guza przez patologa.

Każdy potencjalny pacjent dostarczy wyjściowe 3 probówki krwi z EDTA (łącznie około 30 ml). W tym samym czasie zostanie pobrany mocz (~100 ml) w celu zbadania DNA moczu.

Te próbki krwi będą odwirowywane przez 10 minut przy 3000 obr./min w celu pobrania surowicy i osocza w celu walidacji biomarkerów zidentyfikowanych za pomocą analizy mikromacierzy, selekcji potencjalnych białek wydzielanych we krwi.

Wysięk (opłucnowy lub otrzewnowy) zostanie uzyskany w ramach rutynowych procedur terapeutycznych zgodnie z zaleceniami lekarza prowadzącego, w przypadku których płyny zostałyby wyrzucone. W żadnym momencie płyn wysiękowy nie będzie pozyskiwany wyłącznie do celów tego badania.

Prowadzone będą dalsze prace w zakresie oceny CTC, jednojądrzastych komórek krwi obwodowej, DNA, RNA, białek i innych materiałów genetycznych i molekularnych. Zastosowane techniki będą obejmować ilościowy PCR, sekwencjonowanie, cytometrię przepływową i immunofenotypowanie, immunohistochemię, fluorescencyjną hybrydyzację in situ, hodowlę itp.

Analiza mutacyjna:

Materiał genetyczny zostanie wyekstrahowany z 3-5 ml materiału zatrzymanego na sicie oraz z osocza krwi, a także odpowiedniego materiału, takiego jak wysięk lub mocz. Zostanie to przeanalizowane za pomocą ilościowego PCR przy użyciu specjalnie zaprojektowanych starterów i/lub sekwencjonowania. Materiały genetyczne będą również profilowane przy użyciu technik sekwencjonowania nowej generacji w celu identyfikacji możliwych do zastosowania klinicznego mutacji, takich jak BRAF, ALK, ROS, RET itp.

Próbki będą przetwarzane na świeżo. Wszelkie pozostałe próbki zostaną rozdzielone na kożuszki i osocze i przechowywane w ciekłym azocie i/lub -80C.

Dane i próbki są pozbawiane elementów umożliwiających identyfikację do celów przetwarzania laboratoryjnego. W każdym ośrodku zachowane zostaną informacje łączące pacjenta z próbką. Jest to konieczne do ustalenia dalszych działań.

Zidentyfikowane dane będą znajdować się na komputerze PC podłączonym do sieci, fizycznie zlokalizowanym w Szpitalu Ogólnym Changi i za zaporami instytucjonalnymi. Dane umożliwiające identyfikację osób będą przechowywane w szpitalu i nie będą udostępniane laboratorium.

Dane zostaną zarchiwizowane dla dalszych projektów po zakończeniu badania.