Biomarcadores Plasmáticos y Radiológicos de Respuesta a ECP en Receptores de Trasplante Pulmonar con CLAD

I. Tratamientos con ECP La decisión de prescribir ECP es independiente del estudio y será determinada por el médico tratante del sujeto. Los tratamientos con ECP se realizarán en el respectivo centro de trasplante de pulmón del sujeto según el régimen de tratamiento estándar del centro participante y no se modificarán para los fines de este estudio. Normalmente, los procedimientos se realizan utilizando un calendario de tratamiento que incluye un total de 24 procedimientos durante 6 meses. Se realizan dos procedimientos semanales durante siete semanas (meses 1 y 2), seguidos de procedimientos emparejados cada dos semanas durante el mes 3, y luego una vez al mes durante los meses 4, 5 y 6.

II. Recogida de muestras de sangre Visitas del estudio y parámetros a medir Cuando los sujetos acudan a su primer tratamiento con ECP en su respectivo centro de trasplante de pulmón, se confirmará un formulario de consentimiento informado completado para la participación en el estudio. Las muestras de sangre serán recogidas por el centro que realice los tratamientos con ECP del sujeto en tres momentos durante el ciclo de tratamiento de ECP de 6 meses: 1) inmediatamente antes del primer tratamiento con ECP, 2) inmediatamente antes del decimoquinto tratamiento con ECP al inicio del mes 3, y 3) inmediatamente antes del tratamiento final de ECP de un ciclo completo de tratamiento con ECP.

a. Procedimientos i. Recogida de muestras de sangre: Las muestras de sangre (hasta 25 ml de sangre venosa, 15 ml para análisis de dd-cfDNA y 10 ml para estudios de Treg) se recogerán mediante venopunción o en el momento de la colocación/acceso del catéter intravenoso. Las muestras no clínicas se etiquetarán solo con un número de estudio para mantener la confidencialidad del paciente.

ii. Análisis de dd-cfDNA: Las muestras de sangre completa se recogerán en tubos BCT de cfDNA (Streck Inc., Omaha, NE), y se aislará el plasma. El cfDNA se aislará utilizando un protocolo personalizado y se controlará su calidad con qPCR. El ADN genómico (gDNA) se extraerá, fragmentará y controlará su calidad. Se prepararán bibliotecas de cfDNA de plasma para secuenciación shotgun y se secuenciarán en Illumina HiSeq. Las lecturas de secuencia crudas se recortarán, filtrarán y alinearán al genoma humano para buscar SNPs únicos del donante y del receptor y calcular el % de dd-cfDNA.

iii. Análisis de metilación de cfDNA: El cfDNA o gDNA se tratará con bisulfito, se construirán bibliotecas y se secuenciarán con Illumina NovaSeq. Se comprobará la calidad de las lecturas de secuencia crudas, se recortarán las lecturas y luego se alinearán a un genoma de referencia humano. Después de la deduplicación, se extraerán las señales de metilación de citosina. La composición celular de los orígenes del cfDNA plasmático se descompondrá utilizando el algoritmo del atlas de metilación de tipos celulares humanos.

iv. Análisis de Treg: Se analizarán las características, función y respuesta de los Treg antes, durante y después del ECP. Se recogerán diez (10) mL de sangre completa en tubos heparinizados en momentos específicos en cada centro de sujetos sometidos a ECP. Se aislarán células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y las poblaciones de Treg se clasificarán y enriquecerán para análisis funcionales y fenotípicos posteriores, incluyendo evaluaciones de capacidad supresora, producción de citocinas y expresión de marcadores de superficie.

III. Visitas del estudio de DCE-MRI y parámetros a medir Se evaluará a los sujetos para asegurar que cumplen los criterios básicos de inclusión/exclusión del estudio y no tienen contraindicaciones para la administración de gadolinio o la RMN. Las mujeres en edad fértil se someterán a una prueba de embarazo en orina antes de cada escáner de RMN para confirmar su elegibilidad. Se pedirá a todos los pacientes que completen un formulario de evaluación para RMN antes de cualquier RMN de investigación. Se obtendrá el peso.

RMN: Se realizará una RMN del tórax en dos momentos: 1) antes del primer tratamiento con ECP y 2) después del tratamiento final con ECP, idealmente dentro de las 2 semanas posteriores al tratamiento final con ECP pero no más de 4 semanas después.

Espirometría: Se realizará espirometría el día de la RMN y antes de esta. Si se ha obtenido espirometría en las 4 semanas anteriores para atención clínica, es posible que no se repita en la fecha de la RMN.

1. Fármacos a utilizar Cada sujeto recibirá una dosis única de gadoterato de meglumina (Dotarem®), un agente de contraste para RM basado en gadolinio aprobado por la FDA. El gadoterato de meglumina se administrará en una dosis de 0.05 mmol/kg como una única administración intravenosa.
2. Dispositivos a utilizar Las imágenes de RM se adquirirán utilizando escáneres comerciales de 3 Tesla aprobados por la FDA, utilizando secuencias convencionales aprobadas por la FDA y/o en desarrollo para la adquisición de imágenes.
3. Procedimientos

i. Administración de contraste para RM: Se colocará un catéter intravenoso y se administrará a los sujetos gadoterato de meglumina (Dotarem®) como una inyección intravenosa única de 0.05 mmol/kg, que es la mitad de la dosis recomendada, a una velocidad de 4 cc/segundo seguida de 20 cc de solución salina. El gadoterato de meglumina es un agente de contraste para RM basado en gadolinio aprobado por la FDA. Un médico del personal del estudio estará presente durante la administración del contraste para monitorizar signos y síntomas de hipersensibilidad e hipotensión.

ii. Protocolo de RMN pulmonar: Se adquirirán imágenes de RM centradas en el tórax utilizando escáneres comerciales de 3 Tesla aprobados por la FDA, utilizando secuencias convencionales aprobadas por la FDA y/o en desarrollo para la adquisición de imágenes, que pueden incluir, entre otras, secuencias dinámicas con contraste, ventilación/perfusión y difusión, así como secuencias utilizadas principalmente para evaluar información anatómica. Antes del escaneo, se pedirá a los sujetos que retiren metales (incluyendo joyas, etc.) de su ropa y persona. Los sujetos usarán tapones para los oídos como protección auditiva durante el escaneo. Los sujetos permanecerán inmóviles en posición supina en el escáner con la cabeza cómodamente posicionada sobre una almohada durante la duración del estudio. Los sujetos estarán en comunicación con el/los investigador(es) a través de un intercomunicador bidireccional en todo momento durante el estudio de imágenes. Se animará a los sujetos a comunicar cualquier sensación de incomodidad al investigador inmediatamente. Periódicamente durante la duración del examen de RMN, los investigadores confirmarán que el sujeto está cómodo y desea continuar. La sesión de imágenes completa puede durar hasta 60 minutos. Un médico del personal del estudio estará presente durante la adquisición de imágenes de RM.

iii. Análisis de imágenes de RM: Los investigadores realizarán análisis de cinética de contraste para medir cambios en el espacio microvascular y extracelular extravascular. Se podrán añadir análisis adicionales basados en las secuencias obtenidas. Cualquiera de los hallazgos anteriores podrá compararse con imágenes torácicas obtenidas clínicamente en los pacientes postrasplante.

Las imágenes no serán revisadas rutinariamente por un radiólogo. Si durante el análisis de imágenes se detecta una posible anomalía, se solicitará una consulta formal por un radiólogo. Si se confirma la presencia de una anomalía, el sujeto será contactado por uno de los médicos investigadores. El médico investigador informará al sujeto sobre la anomalía, responderá todas las preguntas y recomendará seguimiento o pruebas adicionales si es necesario. El médico investigador también pedirá permiso al sujeto para contactar a su médico de atención primaria o neumólogo, si es aplicable. La documentación de la anomalía en la RMN podrá colocarse en el historial médico del sujeto.

III. Recopilación de datos Además de la información obtenida de los análisis de cfDNA e imágenes de RM como se detalla anteriormente, los investigadores revisarán y registrarán datos clínicos de los sujetos inscritos en el estudio. Esto incluye la revisión de informes de patología de biopsias pulmonares. La información recopilada nos permitirá determinar la relación, si la hay, entre los hallazgos de cfDNA y RMN pulmonar con los resultados. Estos datos se almacenarán en una base de datos REDCap (Research Electronic Data Capture) protegida con contraseña. Para este estudio, los investigadores registrarán datos demográficos básicos (edad, sexo, género, raza/etnia), datos clínicos (incluyendo informes de patología, otros diagnósticos, medicamentos, historial de tabaquismo), así como mediciones de función pulmonar (capacidad de difusión de monóxido de carbono, FEV1, FVC, capacidad pulmonar total, rendimiento en la prueba de caminata de seis minutos) y varios marcadores sanguíneos o serológicos medidos rutinariamente en el manejo clínico de receptores de trasplante de pulmón según estén disponibles. Los investigadores también podrán registrar los resultados de escáneres de imágenes pulmonares obtenidos clínicamente para monitorizar la progresión de la enfermedad pulmonar y/o pruebas adicionales (como ecocardiograma o prueba de ejercicio cardiopulmonar) que se hayan podido realizar. Además de registrar los datos anteriores al inicio del estudio (línea base), los investigadores también accederán periódicamente a los registros médicos electrónicos del paciente para registrar resultados posteriores de pruebas de función pulmonar (PFT) y otros datos de seguimiento relevantes, como hospitalizaciones y estado vital aproximadamente cada tres meses hasta un tiempo indefinido desde la finalización del estudio.