Плазменные и радиологические биомаркеры ответа на ECP у реципиентов трансплантата легких с CLAD

I. Лечение ЭКП Решение о назначении ЭКП не зависит от исследования и будет определяться лечащим врачом пациента. Процедуры ЭКП будут проводиться в соответствующем центре трансплантации легких пациента в соответствии со стандартным режимом лечения ЭКП участвующего центра и не будут изменяться для целей данного исследования. Как правило, процедуры проводятся по графику лечения, включающему в общей сложности 24 процедуры в течение 6 месяцев. Две процедуры проводятся еженедельно в течение семи недель (месяцы 1 и 2), затем парные процедуры проводятся раз в две недели в течение месяца 3, а затем один раз в месяц в течение месяцев 4, 5 и 6.

II. Сбор образцов крови Посещения исследования и параметры для измерения Когда пациенты приходят на первое лечение ЭКП в своем центре трансплантации легких, будет подтверждено заполнение формы информированного согласия для участия в исследовании. Образцы крови будут собираться центром, проводящим лечение ЭКП пациента, в трех временных точках в течение 6-месячного курса цикла лечения ЭКП: 1) непосредственно перед первым лечением ЭКП, 2) непосредственно перед 15-м лечением ЭКП в начале месяца 3 и 3) непосредственно перед последним лечением ЭКП полного цикла лечения ЭКП.

a. Процедуры i. Сбор образцов крови: Образцы крови (до 25 мл венозной крови, 15 мл для анализа дд-цфДНК и 10 мл для исследований Treg) будут собираться путем венепункции или во время установки/доступа внутривенного катетера. Не клинические образцы будут помечены только номером исследования для сохранения конфиденциальности пациента.

ii. Анализ дд-цфДНК: Образцы цельной крови будут собираться в пробирки cfDNA BCT (Streck Inc., Омаха, NE), и будет выделяться плазма. цфДНК будет выделяться с использованием индивидуального протокола и контролироваться по качеству с помощью qPCR. Геномная ДНК (гДНК) будет экстрагирована, фрагментирована и проконтролирована по качеству. Библиотеки плазменной цфДНК будут подготовлены для дробового секвенирования и секвенированы на Illumina HiSeq. Необработанные последовательности чтений будут обрезаны, отфильтрованы и выровнены по геному человека для поиска уникальных SNP донора и реципиента для вычисления % дд-цфДНК.

iii. Анализ метилирования цфДНК: цфДНК или гДНК будут обработаны бисульфитом, библиотеки будут построены и секвенированы с помощью Illumina NovaSeq. Качество необработанных последовательностей чтений будет проверено, чтения будут обрезаны, а затем выровнены по референсному геному человека. После дедупликации будут извлечены сигналы метилирования цитозина. Клеточный состав источников плазменной цфДНК будет деконволютирован с использованием алгоритма атласа метилирования типов клеток человека.

iv. Анализ Treg: Будут проанализированы характеристики, функция и реакция Treg до, во время и после ЭКП. Десять (10) мл цельной крови будут собираться в гепаринизированные пробирки в указанные временные точки в каждом центре у пациентов, проходящих ЭКП. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) будут выделены, и популяции Treg будут отсортированы и обогащены для последующих функциональных и фенотипических анализов, включая оценку супрессивной способности, продукции цитокинов и экспрессии поверхностных маркеров.

III. Исследование DCE-MRI Посещения и параметры для измерения Пациенты будут проверяться, чтобы убедиться, что они соответствуют основным критериям включения/исключения для исследования и не имеют противопоказаний к введению гадолиния или МРТ. Женщины детородного возраста будут проходить тест на беременность по моче перед каждым сканированием МРТ для подтверждения соответствия критериям. Все пациенты будут просить заполнить форму скрининга МРТ перед любым исследовательским МРТ. Будет измерен вес.

МРТ: МРТ грудной клетки будет проводиться в двух временных точках: 1) до первого лечения ЭКП и 2) после последнего лечения ЭКП, в идеале в течение 2 недель после последнего лечения ЭКП, но не позднее чем через 4 недели.

Спирометрия: Спирометрия будет проводиться в день МРТ и до нее. Если спирометрия была проведена в течение предыдущих 4 недель для клинического наблюдения, спирометрия может не повторяться в день МРТ.

1. Используемые препараты Каждый пациент получит однократную дозу гадотерата меглумина (Dotarem®), одобренного FDA контрастного средства для МРТ на основе гадолиния. Гадотерат меглумин будет вводиться в дозе 0,05 ммоль/кг в виде однократного внутривенного введения.
2. Используемые устройства Изображения МРТ будут получаться с использованием коммерческих, одобренных FDA сканеров на 3 Тесла с использованием обычных, одобренных FDA и/или разрабатываемых последовательностей для получения изображений.
3. Процедуры

i. Введение контраста для МРТ: Будет установлен внутривенный катетер, и пациентам будет вводиться гадотерат меглумин (Dotarem®) в виде однократной внутривенной инъекции 0,05 ммоль/кг, что составляет половину рекомендуемой дозы, со скоростью 4 куб. см/сек с последующим введением 20 куб. см физиологического раствора. Гадотерат меглумин — это одобренное FDA контрастное средство для МРТ на основе гадолиния. Врач исследовательской группы будет присутствовать во время введения контраста для наблюдения за признаками и симптомами гиперчувствительности и гипотензии.

ii. Протокол МРТ легких: Изображения МРТ, сфокусированные на грудной клетке, будут получаться с использованием коммерческих, одобренных FDA сканеров на 3 Тесла с использованием обычных, одобренных FDA последовательностей и/или разрабатываемых последовательностей для получения изображений, которые могут включать, но не ограничиваться, динамическими контрастно-усиленными, вентиляционно-перфузионными и диффузионными последовательностями, а также последовательностями, в основном используемыми для оценки анатомической информации. Перед сканированием пациентов попросят удалить металлические предметы (включая украшения и т.д.) с одежды и тела. Пациенты будут носить беруши для защиты слуха во время сканирования. Пациенты будут лежать неподвижно в положении лежа на спине в сканере с головой, удобно расположенной на подушке, в течение всего исследования. Пациенты будут находиться на связи с исследователем(-ями) через двустороннюю связь в течение всего времени визуализации. Пациентов будут поощрять немедленно сообщать исследователю о любых ощущениях дискомфорта. Периодически в течение МРТ-исследования исследователи будут подтверждать, что пациенту комфортно и он желает продолжать. Вся сессия визуализации может длиться до 60 минут. Врач исследовательской группы будет присутствовать во время получения изображений МРТ.

iii. Анализ изображений МРТ: Исследователи проведут анализ кинетики контраста для измерения изменений в микроциркуляторном и внесосудистом внеклеточном пространстве. Дополнительные анализы могут быть добавлены на основе полученных последовательностей. Любые из вышеуказанных находок могут быть сравнены с визуализацией грудной клетки, которая была получена клинически у пациентов после трансплантации.

Изображения не будут регулярно просматриваться рентгенологом. Если при анализе изображений случайно будет обнаружена потенциальная аномалия, будет запрошена формальная консультация рентгенолога. Если наличие аномалии подтвердится, с пациентом свяжется один из врачей-исследователей. Врач-исследователь проинформирует пациента об аномалии, ответит на все вопросы и порекомендует последующее наблюдение или дополнительные тесты при необходимости. Врач-исследователь также попросит разрешения у пациента связаться с его или ее врачом первичной помощи или пульмонологом, если это применимо. Документация об аномалии МРТ может быть помещена в медицинскую карту пациента.

III. Сбор данных В дополнение к информации, полученной из анализов цфДНК и изображений МРТ, как подробно описано выше, исследователи будут просматривать и записывать клинические данные пациентов, включенных в исследование. Это включает просмотр патологических отчетов биопсий легких. Собранная информация позволит нам определить взаимосвязь, если таковая имеется, между находками цфДНК и МРТ легких с исходами. Эти данные будут храниться в защищенной паролем базе данных REDCap (Research Electronic Data Capture). Для этого исследования исследователи будут записывать основные демографические данные (возраст, пол, гендер, раса/этническая принадлежность), клинические данные (включая патологические отчеты, другие диагнозы, лекарства, история курения), а также измерения функции легких (диффузионная способность по монооксиду углерода, ОФВ1, ФЖЕЛ, общая емкость легких, результаты теста 6-минутной ходьбы) и различные маркеры крови или серологические маркеры, регулярно измеряемые в клиническом ведении реципиентов трансплантата легких, по мере доступности. Исследователи также могут записывать результаты клинически полученных сканирований легких для мониторинга прогрессирования заболевания легких и/или дополнительные тесты (такие как эхокардиограмма или кардиопульмональный нагрузочный тест), которые могли быть выполнены. В дополнение к записи вышеуказанных данных при включении в исследование (базовый уровень), исследователи также будут периодически обращаться к электронным медицинским записям пациента для записи последующих результатов тестов функции легких (ТФЛ) и других соответствующих данных последующего наблюдения, таких как госпитализации и жизненный статус, примерно каждые три месяца в течение неопределенного времени с момента завершения исследования.