Biomarcadores Plasmáticos e Radiológicos de Resposta à ECP em Recetores de Transplante Pulmonar com CLAD

I. Tratamentos com ECP A decisão de prescrever ECP é independente do estudo e será determinada pelo médico assistente do sujeito. Os tratamentos com ECP serão realizados no respetivo centro de transplante pulmonar do sujeito, de acordo com o regime de tratamento ECP padrão do centro participante, e não serão alterados para os fins deste estudo. Normalmente, os procedimentos são realizados utilizando um cronograma de tratamento que inclui um total de 24 procedimentos ao longo de 6 meses. Dois procedimentos são realizados semanalmente durante sete semanas (meses 1 e 2), seguidos por procedimentos emparelhados quinzenalmente no mês 3, e depois uma vez por mês nos meses 4, 5 e 6.

II. Visitas de Estudo de Recolha de Amostras de Sangue e Parâmetros a Serem Medidos Quando os sujeitos se apresentarem para o seu primeiro tratamento com ECP no respetivo centro de transplante pulmonar, será confirmado um formulário de consentimento informado preenchido para participação no estudo. Amostras de sangue serão recolhidas pelo centro que realiza os tratamentos com ECP do sujeito em três momentos ao longo do ciclo de tratamento de 6 meses: 1) imediatamente antes do primeiro tratamento com ECP, 2) imediatamente antes do 15.º tratamento com ECP no início do mês 3, e 3) imediatamente antes do tratamento final de um ciclo completo de tratamento com ECP.

a. Procedimentos i. Recolha de Amostra de Sangue: Amostras de sangue (até 25 ml de sangue venoso, 15 ml para análise de dd-cfDNA e 10 ml para estudos de Treg) serão recolhidas por venopunção ou no momento da colocação/acesso do cateter intravenoso. Amostras não clínicas serão etiquetadas apenas com um número de estudo para manter a confidencialidade do paciente.

ii. Análise de dd-cfDNA: Amostras de sangue total serão recolhidas em tubos cfDNA BCT (Streck Inc., Omaha, NE), e o plasma será isolado. O cfDNA será isolado utilizando um protocolo personalizado e controlado em qualidade com qPCR. O DNA genómico (gDNA) será extraído, fragmentado e controlado em qualidade. Bibliotecas de cfDNA de plasma serão preparadas para sequenciação shotgun e sequenciadas no Illumina HiSeq. Leituras de sequência brutas serão aparadas, filtradas e alinhadas ao genoma humano para pesquisar SNPs únicos do dador e do recetor para calcular a % de dd-cfDNA.

iii. Análise de Metilação de cfDNA: O cfDNA ou gDNA será tratado com bissulfito, bibliotecas construídas e sequenciadas com Illumina NovaSeq. A qualidade das leituras de sequência brutas será verificada, as leituras serão aparadas e depois alinhadas a um genoma de referência humano. Após desduplicação, os sinais de metilação da citosina serão extraídos. A composição celular das origens do cfDNA plasmático será desdobrada usando o algoritmo do atlas de metilação de tipos celulares humanos.

iv. Análise de Treg: As características, função e resposta dos Treg antes, durante e após a ECP serão analisadas. Dez (10) mL de sangue total serão recolhidos em tubos heparinizados em momentos específicos em cada centro de sujeitos submetidos a ECP. Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) serão isoladas e as populações de Treg serão separadas e enriquecidas para análises funcionais e fenotípicas subsequentes, incluindo avaliações da capacidade supressora, produção de citocinas e expressão de marcadores de superfície.

III. Visitas de Estudo de DCE-MRI e Parâmetros a Serem Medidos Os sujeitos serão rastreados para garantir que cumprem os critérios básicos de inclusão/exclusão do estudo e não têm contraindicações para administração de gadolínio ou MRI. Mulheres em idade fértil realizarão um teste de gravidez na urina antes de cada exame de MRI para confirmar elegibilidade. Todos os pacientes serão solicitados a preencher um formulário de rastreio de MRI antes de qualquer MRI de investigação. O peso será obtido.

MRI: O MRI do tórax será realizado em dois momentos: 1) antes do primeiro tratamento com ECP e 2) após o tratamento final com ECP, idealmente dentro de 2 semanas após o tratamento final com ECP, mas não mais de 4 semanas depois.

Espirometria: A espirometria será realizada no dia e antes do MRI. Se a espirometria tiver sido obtida nas 4 semanas anteriores para cuidados clínicos, a espirometria pode não ser repetida na data do MRI.

1. Fármacos a Serem Utilizados Cada sujeito receberá uma dose única de gadoterato de meglumina (Dotarem®), um agente de contraste para RM à base de gadolínio aprovado pela FDA. O gadoterato de meglumina será administrado numa dose de 0,05 mmol/kg como uma administração intravenosa única.
2. Dispositivos a Serem Utilizados As imagens de RM serão adquiridas usando scanners comerciais de 3 Tesla aprovados pela FDA, utilizando sequências convencionais, aprovadas pela FDA e/ou em desenvolvimento para aquisição de imagem.
3. Procedimentos

i. Administração de Contraste para RM: Um cateter intravenoso será colocado, e os sujeitos receberão gadoterato de meglumina (Dotarem®) como uma injeção intravenosa única de 0,05 mmol/kg, que é metade da dose recomendada, a uma taxa de 4 cc/segundo seguida por 20 cc de soro fisiológico. O gadoterato de meglumina é um agente de contraste para RM à base de gadolínio aprovado pela FDA. Um médico da equipa do estudo estará presente durante a administração do contraste para monitorizar sinais e sintomas de hipersensibilidade e hipotensão.

ii. Protocolo de MRI Pulmonar: Imagens de RM focadas no tórax serão adquiridas usando scanners comerciais de 3 Tesla aprovados pela FDA, utilizando sequências convencionais aprovadas pela FDA e/ou sequências em desenvolvimento para aquisição de imagem, que podem incluir, mas não se limitam a, sequências dinâmicas de contraste, ventilação/perfusão e difusão, bem como sequências usadas principalmente para avaliar informações anatómicas. Antes da digitalização, os sujeitos serão solicitados a remover metal (incluindo joias, etc.) da sua roupa e pessoa. Os sujeitos usarão protetores auriculares como proteção auditiva durante a digitalização. Os sujeitos permanecerão imóveis em posição supina no scanner, com a cabeça confortavelmente posicionada numa almofada durante a duração do estudo. Os sujeitos estarão em comunicação com o(s) investigador(es) através de um intercomunicador bidirecional durante todo o estudo de imagem. Os sujeitos serão encorajados a comunicar imediatamente qualquer sensação de desconforto ao investigador. Periodicamente, durante a duração do exame de MRI, os investigadores confirmarão que o sujeito está confortável e deseja continuar. Toda a sessão de imagem pode durar até 60 minutos. Um médico da equipa do estudo estará presente durante a aquisição de imagens de RM.

iii. Análise de Imagem de RM: Os investigadores realizarão análises de cinética de contraste para medir alterações no espaço microvascular e extravascular extracelular. Análises adicionais podem ser adicionadas com base nas sequências obtidas. Qualquer dos achados acima pode ser comparado com imagens torácicas que tenham sido obtidas clinicamente nos pacientes pós-transplante.

As imagens não serão rotineiramente revistas por um radiologista. Se, durante a análise de imagem, for detetada uma potencial anomalia, será solicitada uma consulta formal por um radiologista. Se a presença de uma anomalia for confirmada, o sujeito será contactado por um dos médicos investigadores. O médico investigador informará o sujeito sobre a anomalia, responderá a todas as perguntas e recomendará acompanhamento ou testes adicionais, se necessário. O médico investigador também pedirá permissão ao sujeito para contactar o seu médico de cuidados primários ou pneumologista, se aplicável. A documentação da anomalia de MRI pode ser colocada no registo médico do sujeito.

III. Recolha de Dados Além das informações obtidas a partir das análises de cfDNA e imagens de RM, conforme detalhado acima, os investigadores reverão e registarão dados clínicos dos sujeitos inscritos no estudo. Isto inclui a revisão de relatórios de patologia de biópsias pulmonares. As informações recolhidas permitir-nos-ão determinar a relação, se houver, entre os achados de cfDNA e MRI pulmonar com os resultados. Estes dados serão armazenados numa base de dados REDCap (Research Electronic Data Capture) protegida por palavra-passe. Para este estudo, os investigadores registarão dados demográficos básicos (idade, sexo, género, raça/etnia), dados clínicos (incluindo relatórios de patologia, outros diagnósticos, medicamentos, histórico de tabagismo), bem como medições de função pulmonar (capacidade de difusão de monóxido de carbono, FEV1, FVC, capacidade pulmonar total, desempenho no teste de caminhada de seis minutos) e vários marcadores sanguíneos ou serológicos rotineiramente medidos na gestão clínica de recetores de transplante pulmonar, conforme disponível. Os investigadores também podem registar os resultados de exames de imagem pulmonar obtidos clinicamente para monitorizar a progressão da doença pulmonar e/ou testes adicionais (como ecocardiograma ou teste de exercício cardiopulmonar) que possam ter sido realizados. Além de registar os dados acima na entrada do estudo (linha de base), os investigadores também acederão aos registos médicos eletrónicos do paciente periodicamente para registar resultados subsequentes de testes de função pulmonar (PFT) e outros dados de acompanhamento relevantes, como hospitalizações e estado vital, aproximadamente a cada três meses, por um período indefinido a partir do momento da conclusão do estudo.