Non-kirurgisen hoidon vaikutus periodontitispotilailla keskittyen tulehdusvälittäjäaineisiin ienraontonesteessä (NONSURG)

Parodontiitin käynnistää dysbioottinen mikrobisto, joka asettuu hammaspinnalle hammaskiven taskuun, aiheuttaen kroonista tulehdusta parodontaalikudoksissa ja johtaen lopulta hammasta tukevien kudosten tuhoon ja menetykseen. Vaikea parodontiitti vaikuttaa merkittävään osaan maailman väestöstä ja voi johtaa hampaiden menetykseen. Isännän immuunivasteen parodontaalikudoksissa on vastuussa tapahtumasarjasta, joka johtaa luukadon kehittymiseen. Parodontiitista kärsivässä ikenikudoksessa tunkeutuvat immuunisolut ja paikalliset ikenisolut tuottavat sytokiineja ja matriisia hajottavia entsyymejä parodontopatogeenien poistamiseksi. Ikeniraoneste (GCF) on paikkakohtainen eksudaatti, joka tulehtuneessa ikenessä heijastaa siellä tapahtuvaa tulehdusprosessia, ja tulehdussytokiinit, kuten IL-6, IFN-γ, IL-β GCF:ssä, on osoitettu korreloivan parodontiitin vakavuuden kanssa. Lisäksi GCF on kajoamaton ja helposti kerättävä neste analysoitavaksi. Kemokiinit ovat erikoistunut sytokiinien alaryhmä, joka pääasiassa ohjaa immuunisolujen liikettä tulehduspaikkoihin kemotaksin kautta. Neutrofiilien kotiutuminen on erittäin selektiivinen prosessi, jossa spesifisten neutrofiilien kemoatraktanttien, kuten CXCL1, CXCL2 ja CXCL8, ilmentymisellä on merkittävä rooli parodontiitin patogeneesissä. Lisäksi makrofagien on raportoitu olevan erilaisia aktivaatiotiloja, vaihdellen pro-inflammatorisista anti-inflammatorisiin, parodontaalitaudissa. Makrofagien migraatiota estävä tekijä (MIF) on ratkaisevassa roolissa makrofagien homeostaasin ylläpidossa. Sillä on raportoitu olevan monipuolisia toimintoja, sekä suojaavia että haitallisia vaikutuksia tulehdusprosessiin, luun aineenvaihduntaan, angiogeneesiin ja apoptosiin. Vaskulaarisen endoteliaalisen kasvutekijän-C (VEGF-C) on tärkeä vaskulaarisen endoteliaalisen kasvutekijäperheen jäsen, joka kiihdyttää veri- ja imusuonten kasvua. Lisäksi imusuonten kasvua (lymfangioneesi) ja uudelleenmuodostusta patologisissa olosuhteissa vaikuttavat kemokiinit ja niiden reseptorit, joita imusuo­nen endoteelisolut (LEC) ilmentävät vaikutuksen alaisessa kudoksessa ja sen ympärillä. Lymfangioneesi on yhdistetty parodontaaliseen tulehdukseen hiirillä. Ihmisillä CCL21, ligand, joka on tärkeä dendriittisolujen migraatiolle, on alentunut parodontiittipotilaiden imusuonista. VEGF-C-taso on yhdistetty huonoon ennusteeseen syövissä, ja tutkimukset ovat raportoineet, että MIF:n ja VEGF-C:n ilmentyminen korreloi voimakkaasti. Parhaan tietomme mukaan VEGF-C:n ilmentymistä ihmisen GCF:ssä ei ole koskaan tutkittu. Potilailla, jotka saavat ei-kirurgista parodontaalihoidosta (NSPT), hoidon tavoitteena on tulehduksen hallinta ja parodontaalikudosten paranemisen edistäminen normaalin mikrobiston palauttamisen kautta. Tupakoitsijoilla on aiemmin raportoitu heikentynyt paranemisvaste NSPT:n jälkeen. Tupakointi näyttää muuttavan mikrobikoostumusta ja edistävän keskeisten parodontopatogeenien asuttumista. Uudet todisteet viittaavat siihen, että tietyt sytokiinit ja kemokiinit GCF:ssä toimivat lupaavina biomarkkereina parodontiitin patogeneesin, ennusteen ja vastauksen NSPT:hen määrittämisessä. Tässä tutkimuksessa tutkijat analysoivat kemokiinien/sytokiinien ja VEGF-C:n ilmentymistä GCF:ssä tupakoitsijoilla ja ei-tupakoitsijoilla, joilla on vaikea parodontiitti syvissä taskuissa ennen ja aikana NSPT:tä. Alkutilanteessa tutkijat vertasivat myös näiden merkkiaineiden tasoja matalien ja syvien parodontaalitaskujen välillä tupakoitsijoilla ja ei-tupakoitsijoilla.

Aineisto ja menetelmät Tutkimuspopulaatio: Henkilöt, jotka on lähetetty Länsi-Norjan suun terveyden asiantuntijakeskuksen erikoisvastaanotolle parodontaalihoitoon, kutsuttiin osallistumaan tähän tutkimukseen. Osallistumiskriteerit olivat aiheet, joilla oli diagnosoitu vaiheen III ja IV parodontiitti EFP/AAP-luokitusjärjestelmän mukaan. Kaikilta kelvollisilta osallistujilta (n=30, ikä >16 vuotta) kysyttiin tupakointihistoriasta, ja heidät tunnistettiin tupakoitsijoiksi, jos he olivat tupakoineet viimeisten 5 vuoden aikana. Aiheet suljettiin pois, jos he raportoivat antibioottien käytön viimeisen 6 kuukauden aikana, raskauden, imetyksen, kroonisen suuriannoksisen steroidihoidon, säteilyhoidon tai immunosuppressiivisen hoidon. Heitä ei suljettu pois, jos he raportoivat hyvin säädellyn diabeteksen. Tämä tutkimus hyväksyttiin Länsi-Norjan lääketieteellisen tutkimuksen eettisen toimikunnan (REK) toimesta, 2017/1650/REK Nord. Tiedotettu suostumus saatiin kaikilta potilailta ennen tutkimukseen ottamista. Analyysiin sisältyvien kohteiden kliininen tutkimus Tutkimukseen sisältyvien kohteiden kliininen tutkimus: Taskusyvyyttä (PPD), kliinistä kiinnityskadon (CAL) ja luotauksen aikana tapahtuvaa verenvuotoa (BOP) mitattiin neljästä kohdasta hammasta kohti lukuun ottamatta kolmansia poskihampaita, ja diagnoosin teki yksi parodontologi ensimmäisellä seulontakäynnillä. Tiedot tupakointitottumuksista ja diabeteksesta kerättiin. Ikeniraonesteen (GCF) näytteenotto määritettiin seulonnan jälkeen ja käsitti yhden matalan (≤4mm) ja yhden syvän taskun (≥5 mm) kullekin potilaalle. Vain syviä taskuja olevat hampaat, jotka parodontologi arvioi säilyvän hoidon kolmen aikapisteen jälkeen, valittiin näytteenottoon ennen NSPT:tä alkutilanteessa (T0). GCF kerättiin matalista ja syvistä taskuista T0:ssa, ja syvistä taskuista T1:ssä ja T2:ssä ennen NSPT:tä.

Sama parodontologi tutki ja hoiti kaikkia potilaita NSPT:llä ja keräsi GCF-näytteet. GCF kerättiin kullakin aikapisteellä supragingivaalisen plakin poiston jälkeen kureetilla, ja hampaat eristettiin puuvillarullilla estämään saastuminen syljestä. GCF-näytteet kerättiin käyttämällä suodatinpaperiliuskoja (PerioPaper, OraFlow Inc., Hewlett, New York, USA), jotka työnnettiin subgingivaalisesti, kunnes tuntui kevyt vastus, 30 sekunnin ajan. Liuskat siirrettiin välittömästi Eppendorf-putkiin ja säilytettiin -80 °C:ssa, kunnes ne analysoitiin. Putket liuskoineen punnittiin Mettler Toledo AT261:llä (DeltaRange®, Sveitsi luettavuus: 0.01mg) ennen ja jälkeen näytteenoton saadakseen GCF:n tilavuuden käyttäen kaavaa tilavuus = massa (yksi µl vastaa yhtä mg). Näytteet syvistä ja matalista taskuista säilytettiin erillisissä Eppendorf-putkissa. Jokaiselle putkelle lisättiin Tris-HCL-puskuri (200 µl) lopullisella pitoisuudella 12mM (pH 7.6) proteiinien eluoimiseksi. Kokonaisproteiinipitoisuus kullekin näytteelle mitattiin käyttäen NanoDrop Lite Plus Micro-UV-spektrofotometria (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA) toimittajan ohjeiden mukaisesti. Helmipohjainen immunoanalyysi Käyttäen kaupallisesti saatavaa helmipohjaista immunoanalyysiä Bio-Rad (tuotenumero # 171AK99MR2, BioRad, Hercules, CA, USA), määritettiin 40 kemokiinin/sytokiinin tasot pg/ml. Lisäksi VEGF-C analysoitiin käyttäen Milliplex-paneelia (tuotenumero # HAGP1MAG-12K, Merck KGaA, Darmstadt, Saksa). Valmistajan protokollia noudatettiin kaikille moniparametrisille immunoanalyysipaneelille. Ennen jokaista mittausta järjestelmän kalibrointi ja validointi suoritettiin varmistaakseen helmilukemien tarkkuuden ja luotettavuuden. Jokaisen analyytin standardikäyrä analysoitiin käyttäen viiden parametrin logistista regressiokäyrää Bio-Plex manager -ohjelmistolla (versio 6.0, BioRad). Poikkeamat poistettiin järjestelmän toimesta.

Tilastollinen analyysi Kaikki analyysit suoritettiin R v4.5.2:ssa (28). Kaaviot luotiin käyttäen ggplot2-pakettia R:ssä (29). Kuvailevia tilastoja, mukaan lukien keskiarvo, keskivirhe (SE), mediaani ja prosenttiosuudet, käytettiin tutkimukseen osallistuneiden demografisten ominaisuuksien yhteenvetoon. Alkutilanteen (T0) vertailut syvät vs. matalat taskut: Arvioidaksemme taskusyvyyden ja tupakointistatuksen vaikutuksia, sovitimme sekavaikutusmalleja käyttäen lmer()-funktiota lme4-paketista R:ssä (30). Kiinteiden vaikutusten P-arvot saatiin lmerTest-paketilla (31). Sekavaikutuslähestymistapa valittiin ottamaan huomioon riippuvuus, joka johtuu parittaisesta näytteennostosta yksilöiden sisällä (yksi matala ja yksi syvä parodontaalitasku per potilas), ja yksilölliset satunnaiset leikkauspisteet sisällytettiin satunnaisvaikutukseksi. Malli sisälsi taskusyvyyden (matala vs. syvä), tupakointistatuksen ja niiden vuorovaikutuksen selittäjinä; vuorovaikutustermi poistettiin, kun se oli selvästi ei-merkitsevä (P≥0.1). Näytteen koon rajoitusten vuoksi sukupuolta ja ikää ei sisällytetty kovariaatteina päämalleihin, vaikka niiden mahdollista vaikutusta tutkittiin erillisissä analyyseissä. Pitkittäinen analyysi; toistetun hoidon vaikutukset Arvioidaksemme muutoksia PPD:ssä, CAL:ssa, kemokiinien ilmentymisessä ja GCF:n tilavuudessa NSPT:n jälkeen syvissä taskuissa, analysoimme toistettuja mittauksia, jotka kerättiin kolmella aikapisteellä: alkutilanteessa (T0), seurannassa 1 (T1) ja seurannassa 2 (T2). Jokainen mittaus saatiin samasta kohdasta kunkin potilaan sisällä, tuottaen kolme havaintoa per yksilö. Vastaavasti sovelsimme samantyyppisiä sekavaikutusmalleja, kuten edellä kuvattu, korvaten taskusyvyyden toistetulla NSPT:llä järjestettynä kategorisena selittäjänä (tasot: T0, T1, T2). Vaihtoehtoisena NSPT-vaikutuksille laskimme niiden yksilöiden osuuden, jotka osoittivat parannusta T0:sta T2:een kullekin tulehdusmerkkiaineelle. Yksilöt luokiteltiin onnistuneiksi, jos heillä oli vähenemä NSPT:n jälkeen. Jokaiselle merkkiaineelle testasimme onnistuneiden osuutta käyttäen binomitestiä olettaen nollahypoteesiksi p=0.5 (eli satunnainen jakautuma onnistumisille ja epäonnistumisille). Analyysit suoritettiin erikseen tupakoitsijoille ja ei-tupakoitsijoille sekä yhdistetylle näytteelle. Ottaen huomioon VEGF-C-mittausten jakautumisominaisuudet - erityisesti suuren osuuden nolla-arvoista - data dikotomisoitiin kahteen luokkaan: ei havaittu (0) ja havaittu (1). Tätä binääristä lopputulosta analysoitiin käyttäen yleistettyä lineaarista sekavaikutusmallia (GLMM) binomisen virhejakauman kanssa, toteutettuna glmr()-funktion avulla lme4-paketissa R:lle. Tupakointistatuksen, sukupuolen tai iän vaikutusta ei arvioitu VEGF-C:lle.