Efecto del Tratamiento No Quirúrgico en Pacientes con Periodontitis Centrándose en los Mediadores Inflamatorios del Líquido del Surco Gingival (NONSURG)

La periodontitis se inicia por una microbiota disbiótica que coloniza la superficie dental en la bolsa periodontal, induciendo inflamación crónica en los tejidos periodontales y posteriormente conduciendo a la destrucción y pérdida de los tejidos de soporte dental. La periodontitis grave afecta a una proporción sustancial de la población mundial y puede llevar a la pérdida de dientes. Las respuestas inmunitarias del huésped en los tejidos periodontales son responsables de la cascada de eventos que conducen a la pérdida ósea. En el tejido gingival afectado por periodontitis, las células inmunitarias infiltrantes y las células gingivales residentes producen citocinas y enzimas degradadoras de matriz para eliminar los periodontopatógenos. El fluido crevicular gingival (FCG) es un exudado específico del sitio que en la encía inflamada sirve como reflejo del proceso inflamatorio que tiene lugar allí, y se ha demostrado que las citocinas inflamatorias como IL-6, IFN-γ, IL-β en el FCG se correlacionan con la gravedad de la periodontitis. Además, el FCG es un fluido no invasivo y de fácil recolección para analizar. Las quimiocinas son un subgrupo especializado de citocinas que principalmente dirigen el movimiento de las células inmunitarias a los sitios de inflamación mediante quimiotaxis. La migración de neutrófilos es un proceso altamente selectivo en el que la expresión de atrayentes químicos específicos de neutrófilos, como CXCL1, CXCL2 y CXCL8, juega un papel significativo en la patogénesis de la periodontitis. Además, se informa que los macrófagos tienen un espectro de activación, que va desde proinflamatorio hasta antiinflamatorio, en la enfermedad periodontal. El factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) juega un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis de los macrófagos. Se informa que tiene diversas funciones, con efectos tanto protectores como perjudiciales en el proceso inflamatorio, el metabolismo óseo, la angiogénesis y la apoptosis. El factor de crecimiento endotelial vascular-C (VEGF-C) es un miembro importante de la familia del factor de crecimiento endotelial vascular, que acelera el crecimiento de vasos sanguíneos y linfáticos. Además, el crecimiento (linfangiogénesis) y la remodelación de los vasos linfáticos en condiciones patológicas están influenciados por quimiocinas y sus receptores expresados por las células endoteliales linfáticas (CEL) dentro y alrededor del tejido afectado. La linfangiogénesis se ha relacionado con la inflamación periodontal en ratones. En humanos, CCL21, un ligando importante para la migración de células dendríticas, está regulado a la baja en los linfáticos de pacientes con periodontitis. El nivel de VEGF-C está vinculado a un mal pronóstico en el cáncer, y estudios han reportado que la expresión de MIF y VEGF-C están fuertemente correlacionadas. Hasta donde sabemos, la expresión de VEGF-C en el FCG humano nunca ha sido investigada. En pacientes que reciben terapia periodontal no quirúrgica (TPNQ), el objetivo del tratamiento es controlar la inflamación y promover la cicatrización del tejido periodontal mediante el restablecimiento de la microbiota normal. En fumadores, previamente se reportó una respuesta de cicatrización obstaculizada después de la TPNQ. Fumar parece modular la composición microbiana y promover la colonización de patógenos periodontales clave. La evidencia emergente sugiere que ciertas citocinas y quimiocinas en el FCG sirven como biomarcadores prometedores para determinar la patogénesis, el pronóstico de la periodontitis y la respuesta a la TPNQ. En este estudio, los investigadores analizaron la expresión de quimiocinas/citocinas y VEGF-C en el FCG de fumadores y no fumadores con periodontitis grave dentro de bolsas profundas antes y durante la TPNQ. Al inicio, los investigadores también compararon los niveles de estos marcadores entre bolsas periodontales superficiales y profundas en fumadores y no fumadores.

Material y métodos Población del estudio: Se invitó a participar en el presente estudio a individuos remitidos a la clínica especializada en el Centro de Experiencia en Salud Oral, Noruega Occidental, para tratamiento periodontal. Los criterios de inclusión fueron sujetos diagnosticados con periodontitis en estadios III y IV según el sistema de clasificación EFP/AAP. A todos los participantes elegibles (n=30, edad >16 años) se les preguntó sobre su historial de tabaquismo y se les identificó como fumadores si habían fumado durante los últimos 5 años. Se excluyó a los sujetos si reportaron uso de antibióticos en los últimos 6 meses, embarazo, lactancia, terapia crónica con esteroides en dosis altas, radiación o terapia inmunosupresora. No se excluyeron si reportaron diabetes bien regulada. El presente estudio fue aprobado por el Comité Regional de Ética de Investigación Médica en Noruega Occidental (REK), 2017/1650/REK Nord. Se obtuvieron consentimientos informados de todos los pacientes antes de su inclusión en el estudio. Examen clínico de los sitios incluidos en el análisis Se midieron la profundidad de sondaje de la bolsa (PSB), la pérdida de inserción clínica (PIC) y el sangrado al sondaje (SAS) desde cuatro sitios por diente excepto terceros molares, y el diagnóstico fue realizado por un periodoncista en la primera visita de cribado. Se recopiló información sobre hábitos de tabaquismo y diabetes. El muestreo de fluido crevicular gingival (FCG) se determinó después del cribado y comprendió una bolsa superficial (≤4mm) y una bolsa profunda (≥5 mm) para cada paciente. Solo se seleccionaron para muestreo antes de la TPNQ al inicio (T0) los dientes con bolsas profundas, estimados por el periodoncista como persistentes después de los tres puntos temporales de tratamiento. El FCG se recolectó de bolsas superficiales y profundas en T0, y de bolsas profundas en T1 y T2 antes de la TPNQ.

El mismo periodoncista examinó y trató a todos los pacientes con TPNQ y recolectó las muestras de FCG. El FCG se recolectó en cada punto temporal después de la remoción de placa supragingival con cureta, y los dientes se aislaron con rollos de algodón para prevenir contaminación con saliva. Las muestras de FCG se recolectaron usando tiras de papel de filtro (PerioPaper, OraFlow Inc., Hewlett, Nueva York, EE. UU.) que se insertaron subgingivalmente hasta que hubo una resistencia suave, durante 30s. Las tiras se transfirieron inmediatamente a tubos Eppendorf y se almacenaron a -80 °C hasta su análisis posterior. Los tubos con tiras se pesaron usando Mettler Toledo AT261 (DeltaRange®, Suiza legibilidad: 0.01mg) antes y después del muestreo para obtener el volumen de FCG, usando la fórmula volumen igual a masa (un µl igual a un mg). Las muestras de bolsas profundas y superficiales se mantuvieron en tubos Eppendorf separados. Se añadió tampón Tris-HCL (200 µl) con una concentración final de 12mM (pH 7.6) a cada tubo para la elución de proteínas. La concentración total de proteínas para cada muestra se midió usando el espectrofotómetro micro-UV NanoDrop Lite Plus (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del proveedor. Inmunoensayo Basado en Perlas Utilizando el inmunoensayo basado en perlas disponible comercialmente Bio-Rad (número de catálogo # 171AK99MR2, BioRad, Hercules, CA, EE. UU.), se determinaron los niveles de 40 quimiocinas/citocinas en pg/ml. Además, se analizó VEGF-C usando el panel Milliplex (número de catálogo # HAGP1MAG-12K, Merck KGaA, Darmstadt, Alemania). Se siguieron los protocolos del fabricante para todos los paneles de inmunoensayos multiplex. Antes de cada medición, se realizó la calibración y validación del sistema para garantizar la precisión y fiabilidad de las lecturas de perlas. La curva estándar para cada analito se analizó usando curvas de regresión logística de cinco parámetros utilizando el software Bio-Plex manager (versión 6.0, BioRad). Los valores atípicos fueron eliminados por el sistema.

Análisis estadístico Todos los análisis se realizaron en R v4.5.2 (28). Los gráficos se crearon usando el paquete ggplot2 en R (29). Se utilizaron estadísticas descriptivas incluyendo media, error estándar (EE), mediana y porcentajes para resumir las características demográficas de los participantes del estudio. Comparaciones al inicio (T0) de bolsas profundas vs superficiales: Para evaluar los efectos de la profundidad de la bolsa y el estado de tabaquismo, ajustamos modelos de efectos mixtos usando la función lmer() del paquete lme4 en R (30). Los valores P para los efectos fijos se obtuvieron con el paquete lmerTest (31). Se eligió un enfoque de efectos mixtos para tener en cuenta la dependencia introducida por el muestreo emparejado dentro de los individuos (una bolsa periodontal superficial y una profunda por paciente), con interceptos aleatorios individuales incluidos como el efecto aleatorio. El modelo incluyó profundidad de la bolsa (superficial vs profunda), estado de tabaquismo y su interacción como predictores; el término de interacción se eliminó cuando claramente no significativo (P≥0.1). Debido a limitaciones de tamaño de muestra, el sexo y la edad no se incluyeron como covariables en los modelos primarios, aunque su influencia potencial se exploró en análisis separados. Análisis longitudinal; efectos del tratamiento repetido Para evaluar los cambios en PSB, PIC, expresión de quimiocinas y volumen de FCG después de la TPNQ en bolsas profundas, analizamos mediciones repetidas recolectadas en tres puntos temporales: inicio (T0), seguimiento 1 (T1) y seguimiento 2 (T2). Cada medición se obtuvo del mismo sitio dentro de cada paciente, produciendo tres observaciones por individuo. En consecuencia, aplicamos el mismo tipo de modelos de efectos mixtos descritos anteriormente, reemplazando la profundidad de la bolsa con la TPNQ repetida como un predictor categórico ordenado (niveles: T0, T1, T2). Como alternativa a los efectos de la TPNQ, calculamos la proporción de individuos que mostraron mejora de T0 a T2 para cada marcador inflamatorio. Los individuos se clasificaron como exitosos si exhibían una reducción después de la TPNQ. Para cada marcador, probamos la proporción de éxitos usando una prueba binomial, asumiendo una hipótesis nula de p=0.5 (es decir, una distribución aleatoria de éxitos y fracasos). Los análisis se realizaron por separado para fumadores y no fumadores, así como para la muestra combinada. Dadas las características distribucionales de las mediciones de VEGF-C - específicamente, la alta proporción de valores cero - los datos se dicotomizaron en dos categorías: sin detección (0) y con detección (1). Este resultado binario se analizó usando un modelo lineal generalizado de efectos mixtos (GLMM) con una distribución de error binomial, implementado a través de la función glmr() en el paquete lme4 para R. El efecto del estado de tabaquismo, sexo o edad no se evaluó para VEGF-C.