Efeito do Tratamento Não Cirúrgico de Pacientes com Periodontite Focado nos Mediadores Inflamatórios no Fluido Gengival (NONSURG)

A periodontite é iniciada por uma microbiota disbiótica que coloniza a superfície dentária na bolsa periodontal, induzindo inflamação crónica nos tecidos periodontais e subsequentemente levando à destruição e perda dos tecidos de suporte dentário. A periodontite grave afeta uma proporção substancial da população global e pode levar à perda de dentes. As respostas imunitárias do hospedeiro nos tecidos periodontais são responsáveis pela cascata de eventos que levam à perda óssea. No tecido gengival afetado por periodontite, as células imunitárias infiltradas e as células gengivais residentes produzem citocinas e enzimas degradadoras da matriz para eliminar periodontopatógenos. O fluido crevicular gengival (FCG) é um exsudado específico do local que, na gengiva inflamada, serve como um reflexo do processo inflamatório que aí ocorre, e citocinas inflamatórias como a IL-6, IFN-γ, IL-β no FCG, demonstraram correlacionar-se com a gravidade da periodontite. Adicionalmente, o FCG é um fluido não invasivo e de fácil recolha para análise. As quimiocinas são um subgrupo especializado de citocinas que principalmente direcionam o movimento das células imunitárias para locais de inflamação via quimiotaxia. A homing de neutrófilos é um processo altamente seletivo no qual a expressão de quimioatratores específicos de neutrófilos, como CXCL1, CXCL2 e CXCL8, desempenha um papel significativo na patogénese da periodontite. Além disso, relata-se que os macrófagos têm um espectro de ativação, variando de pró-inflamatório a anti-inflamatório, na doença periodontal. O fator inibidor da migração de macrófagos (MIF) desempenha um papel crucial na manutenção da homeostasia dos macrófagos. Relata-se que tem diversas funções, com efeitos tanto protetores como prejudiciais no processo inflamatório, metabolismo ósseo, angiogénese e apoptose. O fator de crescimento endotelial vascular-C (VEGF-C) é um membro importante da família do fator de crescimento endotelial vascular, acelerando o crescimento de vasos sanguíneos e linfáticos. Além disso, o crescimento (linfangiogénese) e remodelação dos vasos linfáticos em condições patológicas são influenciados por quimiocinas e seus recetores expressos pelas células endoteliais linfáticas (CELs) dentro e ao redor do tecido afetado. A linfangiogénese tem sido associada à inflamação periodontal em ratos. Em humanos, a CCL21, um ligando importante para a migração de células dendríticas, está regulada negativamente nos vasos linfáticos de pacientes com periodontite. O nível de VEGF-C está associado a um mau prognóstico no cancro, e estudos relataram que a expressão de MIF e VEGF-C estão fortemente correlacionadas. Tanto quanto sabemos, a expressão de VEGF-C no FCG humano nunca foi investigada. Em pacientes que recebem terapia periodontal não cirúrgica (TPNC), o objetivo do tratamento é controlar a inflamação e promover a cicatrização do tecido periodontal através do restabelecimento da microbiota normal. Em fumadores, uma resposta de cicatrização prejudicada após TPNC foi relatada anteriormente. Fumar parece modular a composição microbiana e promover a colonização de patógenos periodontais-chave. Evidências emergentes sugerem que certas citocinas e quimiocinas no FCG servem como biomarcadores promissores para determinar a patogénese, prognóstico da periodontite e resposta à TPNC. Neste estudo, os investigadores analisaram a expressão de quimiocinas/citocinas e VEGF-C no FCG de fumadores e não fumadores com periodontite grave dentro de bolsas profundas antes e durante a TPNC. Na linha de base, os investigadores também compararam os níveis destes marcadores entre bolsas periodontais superficiais e profundas em fumadores e não fumadores.

Material e métodos População do estudo: Indivíduos encaminhados para a clínica especializada no Centro de Competências em Saúde Oral, Noruega Ocidental para tratamento periodontal, foram convidados a participar no presente estudo. Os critérios de inclusão foram sujeitos diagnosticados com periodontite de estadio III e IV de acordo com o sistema de classificação EFP/AAP. Todos os participantes elegíveis (n=30, idade >16 anos) foram questionados sobre o seu histórico de tabagismo e identificados como fumadores se fossem fumadores nos últimos 5 anos. Os sujeitos foram excluídos se relatassem uso de antibióticos nos últimos 6 meses, gravidez, lactação, terapia crónica com esteroides em alta dose, radiação ou terapia imunossupressora. Não foram excluídos se relatassem diabetes bem regulada. O presente estudo foi aprovado pelo Comité Regional de Ética em Investigação Médica na Noruega Ocidental (REK), 2017/1650/REK Nord. Consentimentos informados foram obtidos de todos os pacientes antes da inclusão no estudo.Exame clínico dos locais incluídos na análiseA profundidade de sondagem da bolsa (PSB), perda de inserção clínica (PIC) e sangramento à sondagem (SAS) foram medidos em quatro locais por dente, exceto terceiros molares, e o diagnóstico foi realizado por um periodontologista na primeira visita de triagem. Informações sobre hábitos tabágicos e diabetes foram recolhidas. A amostragem do fluido crevicular gengival (FCG) foi determinada após a triagem e compreendeu uma bolsa superficial (≤4mm) e uma bolsa profunda (≥5 mm) para cada paciente. Apenas dentes com bolsas profundas, estimadas pelo periodontologista como persistentes após os três momentos de tratamento, foram selecionados para amostragem antes da TPNC na linha de base (T0). O FCG foi recolhido de bolsas superficiais e profundas em T0, e de bolsas profundas em T1 e T2 antes da TPNC.

O mesmo periodontologista examinou e tratou todos os pacientes com TPNC e recolheu as amostras de FCG. O FCG foi recolhido em cada momento após remoção da placa supragengival com cureta, e os dentes foram isolados com rolos de algodão para evitar contaminação com saliva. As amostras de FCG foram recolhidas utilizando tiras de papel de filtro (PerioPaper, OraFlow Inc., Hewlett, Nova Iorque, EUA) inseridas subgengivalmente até haver resistência suave, durante 30s. As tiras foram imediatamente transferidas para tubos Eppendorf e armazenadas a -80 °C até análise posterior. Os tubos com tiras foram pesados usando Mettler Toledo AT261 (DeltaRange®, Suíça legibilidade: 0,01mg) antes e depois da amostragem para obter o volume de FCG, usando a fórmula volume igual massa (um µl igual a um mg). As amostras de bolsas profundas e superficiais foram mantidas em tubos Eppendorf separados. Tampão Tris-HCL (200 µl) com uma concentração final de 12mM (pH 7,6) foi adicionado a cada tubo para eluição proteica. A concentração proteica total para cada amostra foi medida usando o NanoDrop Lite Plus Micro-UV Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, EUA) seguindo as instruções do fornecedor. Imunoensaio Baseado em Esferas Utilizando o imunoensaio baseado em esferas comercialmente disponível Bio-Rad (número de catálogo # 171AK99MR2, BioRad, Hercules, CA, EUA), os níveis de 40 quimiocinas/citocinas foram determinados em pg/ml. Além disso, o VEGF-C foi analisado usando o painel Milliplex (número de catálogo # HAGP1MAG-12K, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha). Os protocolos do fabricante foram seguidos para todos os painéis de imunoensaios multiplex. Antes de cada medição, a calibração e validação do sistema foram realizadas para garantir a precisão e fiabilidade das leituras das esferas. A curva padrão para cada analito foi analisada usando curvas de regressão logística de cinco parâmetros usando o software Bio-Plex manager (versão 6.0, BioRad). Os valores aberrantes foram removidos pelo sistema.

Análise estatísticaTodas as análises foram conduzidas em R v4.5.2 (28). Os gráficos foram criados usando o pacote ggplot2 em R (29). Estatísticas descritivas incluindo média, erro padrão (EP), mediana e percentagens, foram usadas para resumir as características demográficas dos participantes do estudo. Comparações na linha de base (T0) de bolsas profundas vs superficiais:Para avaliar os efeitos da profundidade da bolsa e estado de tabagismo, ajustámos modelos de efeitos mistos usando a função lmer() do pacote lme4 em R (30). Os valores P para efeitos fixos foram obtidos com o pacote lmerTest (31). Uma abordagem de efeitos mistos foi escolhida para contabilizar a dependência introduzida pela amostragem emparelhada dentro dos indivíduos (uma bolsa periodontal superficial e uma profunda por paciente), com interceptos aleatórios individuais incluídos como efeito aleatório. O modelo incluiu profundidade da bolsa (superficial vs profunda), estado de tabagismo e sua interação como preditores; o termo de interação foi removido quando claramente não significativo (P≥0,1). Devido a restrições de tamanho amostral, sexo e idade não foram incluídos como covariáveis nos modelos primários, embora sua influência potencial tenha sido explorada em análises separadas. Análise longitudinal; efeitos do tratamento repetido Para avaliar mudanças na PSB, PIC, expressão de quimiocinas e volume de FCG após TPNC em bolsas profundas, analisámos medições repetidas recolhidas em três momentos: linha de base (T0), seguimento 1 (T1) e seguimento 2 (T2). Cada medição foi obtida do mesmo local dentro de cada paciente, resultando em três observações por indivíduo. Consequentemente, aplicámos o mesmo tipo de modelos de efeitos mistos descritos acima, substituindo profundidade da bolsa por TPNC repetida como preditor categórico ordenado (níveis: T0, T1, T2). Como alternativa aos efeitos da TPNC, calculámos a proporção de indivíduos que mostraram melhoria de T0 para T2 para cada marcador inflamatório. Os indivíduos foram classificados como bem-sucedidos se exibissem uma redução após TPNC. Para cada marcador, testámos a proporção de sucessos usando um teste binomial, assumindo uma hipótese nula de p=0,5 (ou seja, uma distribuição aleatória de sucessos e falhas). As análises foram realizadas separadamente para fumadores e não fumadores, bem como para a amostra combinada.Dadas as características distribucionais das medições de VEGF-C - especificamente, a alta proporção de valores zero - os dados foram dicotomizados em duas categorias: não detetado (0) e detetado (1). Este resultado binário foi analisado usando um modelo linear generalizado de efeitos mistos (GLMM) com uma distribuição de erro binomial, implementado via função glmr() no pacote lme4 para R. O efeito do estado de tabagismo, sexo ou idade não foi avaliado para o VEGF-C.