NMR-pohjainen aineenvaihduntakinetiikka ARDS-potilailla

Tätä tutkimusta varten kaikki aikuiset teho-osastopotilaat seulotaan ARDS:n varalta. Osallistujia, jotka täyttävät lievän ARDS:n (PaO2/FiO2 200-300) kriteerit, harkitaan mahdollista osallistumista. Vertailevaa analyysiä varten tutkimukseen sisällytetään myös ikään sopivat terveet kontrollit. Tutkijat aikovat käsitellä verinäytteitä, jotka on otettu osallistujilta, joilla on lievä ARDS. Ensimmäiset näytteet otetaan 72 tunnin kuluessa lievän ARDS:n diagnostisten kriteerien täyttymisestä, sen jälkeen 72 tunnin välein, kunnes osallistujat toipuvat ARDS:sta tai kotiutuivat teho-osastolta, tai kolmen viikon kuluessa sisällyttämisestä sen mukaan, kumpi tulee ensin. Seerumin valmistusta varten kerätään 2 ml verinäytteitä keräyspulloon, jonka annetaan hyytyä 60 minuuttia huoneenlämmössä. Sitten näytteet sentrifugoidaan 1 200 x g:llä 10 minuuttia, kerätään eppendorf-putkiin, suljetaan ja pakastetaan -80 celsiusasteessa, kunnes NMR-kokeet suoritetaan. Muita 1D- ja 2D-NMR-spektroskooppisia tekniikoita käytetään seerumin erilaisten metabolisten komponenttien karakterisointiin ja kvantitointiin.

Tämä tutkimus on luonteeltaan tutkiva, jotta voidaan ymmärtää NMR-pohjaisen metabolomiikan kinetiikkaa ARDS-populaatiossa. Koska noin 20-25 % lievistä ARDS:ista etenee lopulta vaikeaksi ARDS:ksi, tutkijoihin kuuluu yhteensä 120 osallistujaa (mukaan lukien terveet osallistujat). Tiedonkeruu ymmärtää demografisen profiilin, kliiniset ominaisuudet ja sairauden vaikeusasteen pisteet Sequential Organ Failure Assessment (SOFA) -pisteet tutkimukseen osallistumishetkellä, kliinisen kulun teho-osastolla oleskelun aikana ja osallistujien tulokset tehdään.

Näytteen NMR-spektroskopia (800 MHz Bruker) suoritetaan käyttämällä ulkoista putkea, joka sisältää trimetyylisilyylipropaanihappoa (TSP), D2O signaalin lukitsemiseksi. Plasma/seeruminäytteet sulatetaan ja sen jälkeen sentrifugoidaan 10 000 g:llä 5 minuuttia 4 °C:ssa mahdollisten kiinteiden roskien poistamiseksi. 450 μl kutakin näytettä sekoitetaan perusteellisesti 50 μl:n kanssa NMR-puskuria (1,5 MKH2PO4, 2 mM NaN3, 5). mM natrium-3-(trimetyylisilyyli)propionaatti-2,2,3,3-d4, D2O, pH 7,4) ja saatu liuos siirretään 5 mm tai 3 mm NMR-putkiin. Kaikki yksiulotteiset spektrit veden vaimennuksen kanssa saadaan. Protonispektrit viitataan TSP-signaaliin (δ = 0,00 ppm). Ilmaiset induktiovaimentimet (FID) käsitellään viivalevennyksellä ja nollatäyttöön ennen Fourier-muunnosta. Saadut spektrit vaiheistetaan manuaalisesti; perusviiva korjattu ja integroitu TOPSPIN 2.1:n avulla.

Kaikki NMR-spektrit käsitellään ja analysoidaan käyttämällä TOPSIN 3 -pakettia. Automaattinen ja valvottu huippujen poiminta suoritetaan Amixilla ja metaboliittien tunnistus tehdään Metaboanlaystin ja BIOREFCODE-metaboliittitietokannan avulla. Suoritetaan tavallinen tilastollinen valvottu ja valvomaton monimuuttuja-analyysi (PCA ja PLSDA).

Metaboliitit seeruminäytteiden 1H NMR -spektreissä osoitetaan käyttämällä 1D-, 2D-, HMDB- ja BMRB-tietokantaa. 1D-spektrissä esiintyvät pienet metaboliittien päällekkäiset resonanssit vahvistetaan käyttämällä 2D-spektrejä, mukaan lukien heteronukleaarinen yksikvanttikorrelaatio (HSQC), korrelaatiospektroskopia (COSY), kokonaiskorrelaatiospektroskopia (TOCSY), J-resoluutio (JRES) ja ihmisen aineenvaihduntatietokanta ja biologinen magneettinen resonanssipankki (BMRB) tietokanta.