Cinética metabolômica baseada em RMN em pacientes com SDRA

Para este estudo, todos os pacientes adultos da UTI serão examinados para SDRA. Os participantes que atenderem aos critérios de SDRA leve (PaO2/FiO2 200-300) serão considerados para possível inclusão. Para análise comparativa, controle saudável de mesma idade também será incluído no estudo. Os investigadores estão planejando trabalhar nas amostras de sangue coletadas dos participantes com SDRA leve. As primeiras amostras serão coletadas dentro de 72 horas após o cumprimento dos critérios diagnósticos de SDRA leve e, posteriormente, a cada 72 horas até que os participantes se recuperem da SDRA ou alta da UTI ou três semanas após a inclusão, o que ocorrer primeiro. Para o preparo do soro, serão obtidos 2 ml de amostras de sangue em frasco de coleta, deixados coagular por 60 minutos em temperatura ambiente. As amostras serão então centrifugadas a 1.200 × g por 10 minutos, coletadas em tubos eppendorf, selados e congelados a menos 80 graus Celsius até que os experimentos de RMN sejam realizados. Outras técnicas espectroscópicas de RMN 1D e 2D serão utilizadas para a caracterização e quantificação de vários componentes metabólicos do soro.

Este estudo é de natureza exploratória para compreender a cinética da metabolômica baseada em RMN na população com SDRA. Considerando que aproximadamente 20-25% da SDRA leve eventualmente progredirá para SDRA grave, os investigadores incluirão um total de 120 participantes (incluindo participantes saudáveis). A coleta de dados para compreender o perfil demográfico, características clínicas e pontuação de gravidade da doença Pontuação de avaliação de falha sequencial de órgãos (SOFA) no momento da inclusão no estudo, curso clínico durante a permanência na UTI e resultado dos participantes será feito.

A espectroscopia de RMN (800 MHz Bruker) da amostra será realizada utilizando um tubo externo contendo ácido trimetilsilil propanóico (TSP), D2O para travar o sinal. As amostras de plasma/soro serão descongeladas e posteriormente centrifugadas a 10.000g por 5 min a 4°C para remover quaisquer detritos sólidos, 450 μl de cada amostra serão completamente misturados com 50 μl de tampão NMR (1,5 MKH2PO4, 2 mM NaN3, 5,8 mM de 3-(trimetilsilil)propionato de sódio-2,2,3,3-d4, D2O, pH 7,4) e a solução resultante será transferida para tubos de RMN de 5 mm ou 3 mm. Todos os espectros unidimensionais com supressão de água serão obtidos. Os espectros de prótons serão referenciados ao sinal TSP (δ=0,00 ppm). Os decaimentos de indução livres (FIDs) serão processados ​​com alargamento de linha e preenchido com zero antes da transformação de Fourier. Os espectros adquiridos serão faseados manualmente; linha de base corrigida e integrada usando TOPSPIN 2.1.

Todos os espectros de RMN serão processados ​​e analisados ​​utilizando o pacote TOPSIN 3. A coleta automática e supervisionada de picos será realizada com Amix e a identificação de metabólitos será feita usando o banco de dados de metabólitos Metaboanlayst e BIOREFCODE. Análise multivariada estatística padrão supervisionada e não supervisionada (PCA e PLSDA) será realizada.

Os metabólitos nos espectros de RMN de 1H de amostras de soro serão atribuídos usando banco de dados 1D, 2D, HMDB e BBMRB. Ressonâncias sobrepostas de pequenos metabólitos presentes no espectro 1D serão confirmadas usando espectros 2D incluindo correlação quântica única heteronuclear (HSQC), espectroscopia de correlação (COSY), espectroscopia de correlação total (TOCSY), J-resolvido (JRES) e banco de dados de metabolome humano e magnético biológico banco de dados de banco de ressonância (BMRB).