Metabolomická kinetika založená na NMR u pacientů s ARDS

Pro tuto studii budou všichni dospělí pacienti na JIP podrobeni screeningu na ARDS. Účastníci, kteří splňují kritéria mírného ARDS (PaO2/FiO2 200-300), budou zvažováni pro případné zařazení. Pro srovnávací analýzu bude do studie zahrnuta také zdravá kontrola odpovídající věku. Vyšetřovatelé plánují pracovat na krevních vzorcích odebraných účastníkům s mírným ARDS. První vzorky budou odebrány do 72 hodin od splnění diagnostických kritérií mírného ARDS, poté každých 72 hodin, dokud se účastníci nezotaví z ARDS nebo propuštění z JIP, nebo tři týdny po zařazení, podle toho, co nastane dříve. Pro přípravu séra se do odběrové lahvičky odeberou 2 ml vzorků krve, které se nechají srážet 60 minut při pokojové teplotě. Vzorky budou poté centrifugovány při 1200 x g po dobu 10 minut, shromážděny do eppendorfových zkumavek, uzavřeny a zmraženy při teplotě minus 80 stupňů Celsia, dokud nebudou provedeny experimenty NMR. Další 1D a 2D NMR spektroskopické techniky budou použity pro charakterizaci a kvantifikaci různých metabolických složek séra.

Tato studie je svou povahou průzkumná pro pochopení kinetiky metabolomiky založené na NMR v populaci ARDS. Vzhledem k tomu, že přibližně 20–25 % mírného ARDS nakonec přejde do závažného ARDS, vyšetřovatelé zahrnou celkem 120 účastníků (včetně zdravých účastníků). Sběr dat zahrnuje demografický profil, klinické charakteristiky a skóre závažnosti onemocnění skóre sekvenčního hodnocení orgánového selhání (SOFA) v době zařazení do studie, klinický průběh během pobytu na JIP a výsledky účastníků.

NMR spektroskopie (800-MHz Bruker) vzorku bude provedena pomocí externí zkumavky obsahující kyselinu trimethylsilylpropanovou (TSP), D2O pro uzamčení signálu. Vzorky plazmy/séra budou rozmraženy a následně centrifugovány při 10 000 g po dobu 5 minut při 4 °C, aby se odstranily veškeré pevné zbytky, 450 μl každého vzorku se důkladně promíchá s 50 μl NMR pufru (1,5 MKH2PO4, 2 mM NaN3, 5,8 mM 3-(trimethylsilyl)propionát-2,2,3,3-d4, D20, pH 7,4) a výsledný roztok se přenese do 5 mm nebo 3 mm NMR zkumavek. Budou získána všechna jednorozměrná spektra s potlačením vody. Protonová spektra budou vztažena k signálu TSP (δ=0,00 ppm). Volné indukční rozpady (FID) budou zpracovány s rozšířením čáry a vyplněním nuly před Fourierovou transformací. Získaná spektra budou manuálně fázována; základní linie opravena a integrována pomocí TOPSPIN 2.1.

Všechna NMR spektra budou zpracována a analyzována pomocí balíčku TOPSIN 3. Automatický a kontrolovaný výběr píku bude proveden s Amixem a identifikace metabolitů bude provedena pomocí Metaboanlayst a databáze metabolitů BIOREFCODE. Bude provedena standardní statistická řízená a nekontrolovaná multivariační analýza (PCA a PLSDA).

Metabolity v 1H NMR spektrech vzorků séra budou přiřazeny pomocí 1D, 2D, HMDB a BMRB databáze. Překrývající se rezonance malých metabolitů přítomné v 1D spektru budou potvrzeny pomocí 2D spekter včetně heteronukleární jednoduché kvantové korelace (HSQC), korelační spektroskopie (COSY), celkové korelační spektroskopie (TOCSY), J-rozlišené (JRES) a databáze lidského metabolomu a biologické magnetické databáze rezonanční banky (BMRB).