Kinetyka metabolomiki oparta na NMR u pacjentów z ARDS

Na potrzeby tego badania wszyscy dorośli pacjenci OIOM-u zostaną poddani badaniom przesiewowym w kierunku ARDS. Uczestnicy spełniający kryteria łagodnego ARDS (PaO2/FiO2 200–300) będą brani pod uwagę przy ewentualnym włączeniu. Do analizy porównawczej w badaniu uwzględniona zostanie również zdrowa grupa kontrolna dobrana pod względem wieku. Badacze planują pracować na próbkach krwi pobranych od uczestników cierpiących na łagodny ARDS. Pierwsze próbki będą pobierane w ciągu 72 godzin od spełnienia kryteriów diagnostycznych łagodnego ARDS, następnie co 72 godziny do czasu wyzdrowienia uczestników z ARDS lub wypisania ich z OIT lub trzech tygodni po włączeniu, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. W celu przygotowania surowicy, do fiolki do pobierania zostanie pobrane 2 ml próbek krwi, pozostawionych do skrzepnięcia na 60 minut w temperaturze pokojowej. Próbki zostaną następnie odwirowane przy 1200 x g przez 10 minut, zebrane w probówkach Eppendorfa, szczelnie zamknięte i zamrożone w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu przeprowadzenia eksperymentów NMR. Dalsze techniki spektroskopowe 1D i 2D NMR zostaną wykorzystane do charakteryzowania i oznaczania ilościowego różnych składników metabolicznych surowicy.

Badanie to ma charakter eksploracyjny i ma na celu zrozumienie kinetyki metabolomiki opartej na NMR w populacji ARDS. Biorąc pod uwagę, że około 20–25% łagodnego ARDS ostatecznie przejdzie do ciężkiego ARDS, badacze obejmą łącznie 120 uczestników (w tym zdrowych uczestników). Gromadzenie danych obejmuje profil demograficzny, charakterystykę kliniczną i wynik ciężkości choroby, wynik sekwencyjnej oceny niewydolności narządów (SOFA) w momencie włączenia do badania, przebieg kliniczny podczas pobytu na OIOM-ie oraz wyniki uczestników.

Spektroskopia NMR (800 MHz Bruker) próbki zostanie przeprowadzona przy użyciu zewnętrznej probówki zawierającej kwas trimetylosililopropanowy (TSP), D2O w celu zablokowania sygnału. Próbki osocza/surowicy zostaną rozmrożone, a następnie odwirowane przy 10 000 g przez 5 minut w temperaturze 4°C w celu usunięcia wszelkich stałych zanieczyszczeń. 450 µl każdej próbki zostanie dokładnie wymieszane z 50 µl buforu NMR (1,5 MKH2PO4, 2 mM NaN3, 5,8 mM 3-(trimetylosililo)propionian-2,2,3,3-d4, D2O, pH 7,4) i powstały roztwór przenosi się do probówek NMR o średnicy 5 mm lub 3 mm. Otrzymane zostaną wszystkie jednowymiarowe widma z tłumieniem wody. Widma protonów będą odniesione do sygnału TSP (δ=0,00 ppm). Zaniki indukcji swobodnej (FID) będą przetwarzane z poszerzaniem linii i wypełnianiem zer przed transformacją Fouriera. Pozyskane widma będą ręcznie fazowane; linia bazowa skorygowana i zintegrowana przy użyciu TOPSPIN 2.1.

Wszystkie widma NMR będą przetwarzane i analizowane przy użyciu pakietu TOPSIN 3. Automatyczne i nadzorowane zbieranie pików będzie przeprowadzane za pomocą Amix, a identyfikacja metabolitów będzie odbywać się przy użyciu bazy danych metabolitów Metaboanlayst i BIOREFCODE. Przeprowadzona zostanie standardowa statystyczna nadzorowana i nienadzorowana analiza wieloczynnikowa (PCA i PLSDA).

Metabolity w widmach 1H NMR próbek surowicy zostaną przypisane przy użyciu baz danych 1D, 2D, HMDB i BMRB. Nakładające się rezonanse małych metabolitów obecne w widmie 1D zostaną potwierdzone za pomocą widm 2D, w tym heterojądrowej pojedynczej korelacji kwantowej (HSQC), spektroskopii korelacyjnej (COSY), spektroskopii korelacji całkowitej (TOCSY), J-rozdzielczej (JRES) oraz bazy danych metabolomu człowieka i biologicznego pola magnetycznego baza danych banku rezonansowego (BMRB).