Метаболомика на основе ЯМР Кинетика у пациентов с ОРДС

В рамках этого исследования все взрослые пациенты отделения интенсивной терапии будут проверены на ОРДС. Участники, соответствующие критериям легкого ОРДС (PaO2/FiO2 200–300), будут рассматриваться для возможного включения. Для сравнительного анализа в исследование также будет включен здоровый контроль соответствующего возраста. Следователи планируют работать с образцами крови, взятыми у участников с легкой формой ОРДС. Первые образцы будут собираться в течение 72 часов после достижения диагностических критериев легкой степени ОРДС, затем каждые 72 часа до выздоровления участников от ОРДС или выписки из отделения интенсивной терапии или через три недели после включения, в зависимости от того, что наступит раньше. Для приготовления сыворотки во флакон для сбора берут 2 мл образцов крови, оставляют для свертывания в течение 60 минут при комнатной температуре. Затем образцы будут центрифугированы при 1200 × g в течение 10 минут, собраны в пробирки Эппендорфа, запечатаны и заморожены при температуре минус 80 градусов Цельсия до проведения экспериментов ЯМР. В дальнейшем методы 1D- и 2D-ЯМР-спектроскопии будут использоваться для характеристики и количественного определения различных метаболических компонентов сыворотки.

Это исследование носит исследовательский характер, чтобы понять кинетику метаболомики на основе ЯМР у населения с ОРДС. Учитывая, что примерно 20-25% легких ОРДС в конечном итоге перерастают в тяжелую форму ОРДС, в число исследователей войдут в общей сложности 120 участников (включая здоровых участников). Сбор данных включает демографический профиль, клинические характеристики и оценку тяжести заболевания. Оценка последовательной органной недостаточности (SOFA) на момент включения в исследование, клиническое течение во время пребывания в отделении интенсивной терапии и результаты участников будут выполнены.

ЯМР-спектроскопия (800 МГц Bruker) образца будет выполняться с использованием внешней трубки, содержащей триметилсилилпропановую кислоту (TSP), D2O для фиксации сигнала. Образцы плазмы/сыворотки размораживают, а затем центрифугируют при 10 000 g в течение 5 минут при 4°C для удаления твердых частиц. 450 мкл каждого образца тщательно смешивают с 50 мкл буфера для ЯМР (1,5 MKH2PO4, 2 мМ NaN3, 5,8 мМ натрия 3-(триметилсилил)пропионат-2,2,3,3-d4, D2O, pH 7,4), и полученный раствор переносят в пробирки ЯМР диаметром 5 или 3 мм. Будут получены все одномерные спектры с подавлением воды. Спектры протонов будут привязаны к сигналу TSP (δ=0,00 ppm). Перед преобразованием Фурье затухание свободной индукции (FID) будет обработано с уширением линии и заполнением нулями. Полученные спектры будут фазированы вручную; базовая линия скорректирована и интегрирована с помощью TOPSPIN 2.1.

Все спектры ЯМР будут обработаны и проанализированы с использованием пакета TOPSIN 3. Автоматический и контролируемый отбор пиков будет осуществляться с помощью Amix, а идентификация метаболитов будет осуществляться с использованием базы данных метаболитов Metaboanlayst и BIOREFCODE. Будет выполнен стандартный статистический многомерный анализ с учителем и без надзора (PCA и PLSDA).

Метаболиты в спектрах 1H ЯМР образцов сыворотки будут определены с использованием баз данных 1D, 2D, HMDB и BMRB. Небольшие перекрывающиеся резонансы метаболитов, присутствующие в 1D-спектре, будут подтверждены с использованием 2D-спектров, включая гетероядерную одноквантовую корреляцию (HSQC), корреляционную спектроскопию (COSY), полную корреляционную спектроскопию (TOCSY), J-разрешение (JRES), базу данных метаболома человека и биологическую магнитную база данных резонансного банка (BMRB).