Cinética metabolómica basada en RMN en pacientes con SDRA

Para este estudio, todos los pacientes adultos de la UCI serán examinados para detectar SDRA. Los participantes que cumplan con los criterios de SDRA leve (PaO2/FiO2 200-300) serán considerados para una posible inclusión. Para el análisis comparativo, también se incluirá en el estudio un control sano de la misma edad. Los investigadores planean trabajar con las muestras de sangre recolectadas de los participantes que tienen SDRA leve. Las primeras muestras se recolectarán dentro de las 72 horas posteriores al cumplimiento de los criterios de diagnóstico de SDRA leve, posteriormente cada 72 horas hasta que los participantes se recuperen del SDRA o sean dados de alta de la UCI o tres semanas después de la inclusión, lo que ocurra primero. Para la preparación del suero, se obtendrán 2 ml de muestras de sangre en un vial de recolección y se dejarán coagular durante 60 minutos a temperatura ambiente. Luego, las muestras se centrifugarán a 1200 × g durante 10 minutos, se recogerán en tubos Eppendorf, se sellarán y se congelarán a menos 80 grados Celsius hasta que se realicen los experimentos de RMN. Se utilizarán otras técnicas espectroscópicas de RMN 1D y 2D para la caracterización y cuantificación de diversos componentes metabólicos del suero.

Este estudio es de naturaleza exploratoria para comprender la cinética de la metabolómica basada en RMN en la población con SDRA. Considerando que aproximadamente entre el 20 y el 25% del SDRA leve eventualmente progresará a SDRA grave, los investigadores incluirán un total de 120 participantes (incluidos participantes sanos). Recopilación de datos para comprender el perfil demográfico, las características clínicas y la puntuación de gravedad de la enfermedad. Puntuación de la Evaluación de insuficiencia orgánica secuencial (SOFA) en el momento de la inclusión del estudio, el curso clínico durante la estancia en la UCI y el resultado de los participantes.

La espectroscopia de RMN (Bruker de 800 MHz) de la muestra se realizará utilizando un tubo externo que contiene ácido trimetilsilil propanoico (TSP), D2O para bloquear la señal. Las muestras de plasma/suero se descongelarán y posteriormente se centrifugarán a 10.000 g durante 5 minutos a 4 °C para eliminar cualquier residuo sólido; se mezclarán completamente 450 µl de cada muestra con 50 µl de tampón de RMN (1,5 MKH2PO4, NaN3 2 mM, 5,8 3-(trimetilsilil)propionato-2,2,3,3-d4 de sodio mM, D2O, pH 7,4) y la solución resultante se transferirá a tubos de RMN de 5 mm o 3 mm. Se obtendrán todos los espectros unidimensionales con supresión de agua. Los espectros de protones estarán referenciados a la señal TSP (δ=0.00 ppm). Las desintegraciones de inducción libre (FID) se procesarán con ampliación de línea y relleno de ceros antes de la transformación de Fourier. Los espectros adquiridos se desfasarán manualmente; Línea de base corregida e integrada usando TOPSPIN 2.1.

Todos los espectros de RMN se procesarán y analizarán utilizando el paquete TOPSIN 3. La selección de picos automática y supervisada se realizará con Amix y la identificación de metabolitos se realizará utilizando Metaboanlayst y la base de datos de metabolitos BIOREFCODE. Se realizará un análisis multivariado estadístico estándar supervisado y no supervisado (PCA y PLSDA).

Los metabolitos en los espectros de 1H NMR de muestras de suero se asignarán utilizando las bases de datos 1D, 2D, HMDB y BMRB. Las resonancias superpuestas de metabolitos pequeños presentes en el espectro 1D se confirmarán mediante el uso de espectros 2D que incluyen correlación cuántica única heteronuclear (HSQC), espectroscopia de correlación (COSY), espectroscopia de correlación total (TOCSY), resolución J (JRES) y base de datos del metaboloma humano y magnético biológico. Base de datos del banco de resonancia (BMRB).