Cinetica metabolomica basata su NMR nei pazienti con ARDS

Per questo studio, tutti i pazienti adulti in terapia intensiva saranno sottoposti a screening per ARDS. I partecipanti che soddisfano i criteri di ARDS lieve (PaO2/FiO2 200-300) verranno presi in considerazione per una possibile inclusione. Per l'analisi comparativa, nello studio sarà incluso anche un controllo sano corrispondente all'età. Gli investigatori stanno pianificando di lavorare sui campioni di sangue raccolti dai partecipanti affetti da ARDS lieve. I primi campioni verranno raccolti entro 72 ore dal soddisfacimento dei criteri diagnostici di ARDS lieve, successivamente ogni 72 ore fino al recupero dei partecipanti dall'ARDS o alla dimissione dall'unità di terapia intensiva o tre settimane dopo l'inclusione, a seconda di quale evento si verifichi per primo. Per la preparazione del siero, verranno prelevati 2 ml di campioni di sangue in una fiala di raccolta, lasciati coagulare per 60 minuti a temperatura ambiente. I campioni verranno quindi centrifugati a 1.200 × g per 10 minuti, raccolti in provette eppendorf, sigillati e congelati a meno 80 gradi Celsius fino all'esecuzione degli esperimenti NMR. Ulteriori tecniche spettroscopiche NMR 1D e 2D verranno utilizzate per la caratterizzazione e la quantificazione di vari componenti metabolici del siero.

Questo studio è di natura esplorativa per comprendere la cinetica della metabolomica basata su NMR nella popolazione ARDS. Considerando che circa il 20-25% dell'ARDS lieve passerà infine all'ARDS grave, i ricercatori includeranno un totale di 120 partecipanti (compresi i partecipanti sani). Verranno raccolti i dati che comprendono il profilo demografico, le caratteristiche cliniche e il punteggio di gravità della malattia. Il punteggio SOFA (Sequential Organ Failure Assessment) al momento dell'inclusione nello studio, il decorso clinico durante la permanenza in terapia intensiva e gli esiti dei partecipanti.

La spettroscopia NMR (Bruker a 800 MHz) del campione verrà eseguita utilizzando un tubo esterno contenente acido trimetilsilil propanoico (TSP), D2O per bloccare il segnale. I campioni di plasma/siero verranno scongelati e successivamente centrifugati a 10.000 g per 5 minuti a 4°C per rimuovere eventuali detriti solidi, 450 μl di ciascun campione verranno accuratamente miscelati con 50 μl di tampone NMR (1,5 MKH2PO4, 2 mM NaN3, 5,8 mM sodio 3-(trimetilsilil) propionato-2,2,3,3-d4, D2O, pH 7,4) e la soluzione risultante verrà trasferita in provette NMR da 5 mm o 3 mm. Verranno ottenuti tutti gli spettri unidimensionali con soppressione dell'acqua. Gli spettri dei protoni saranno riferiti al segnale TSP (δ=0.00 ppm). I decadimenti dell'induzione libera (FID) verranno elaborati con allargamento della linea e riempimento dello zero prima della trasformazione di Fourier. Gli spettri acquisiti verranno fasati manualmente; linea di base corretta e integrata utilizzando TOPSPIN 2.1.

Tutti gli spettri NMR verranno elaborati e analizzati utilizzando il pacchetto TOPSIN 3. Il peak picking automatico e supervisionato verrà eseguito con Amix e l'identificazione dei metaboliti verrà effettuata utilizzando il database dei metaboliti Metaboanlayst e BIOREFCODE. Verranno eseguite analisi multivariate statistiche standard supervisionate e non supervisionate (PCA e PLSDA).

I metaboliti negli spettri 1H NMR dei campioni di siero verranno assegnati utilizzando i database 1D, 2D, HMDB e BMRB. Le risonanze sovrapposte di piccoli metaboliti presenti nello spettro 1D saranno confermate utilizzando spettri 2D tra cui correlazione quantistica singola eteronucleare (HSQC), spettroscopia di correlazione (COSY), spettroscopia di correlazione totale (TOCSY), J-resolved (JRES) e database del metaboloma umano e magnetico biologico banca dati della banca di risonanza (BMRB).