NMR-basierte Metabolomics-Kinetik bei ARDS-Patienten

Für diese Studie werden alle erwachsenen Intensivpatienten auf ARDS untersucht. Teilnehmer, die die Kriterien eines leichten ARDS (PaO2/FiO2 200-300) erfüllen, werden für eine mögliche Aufnahme in Betracht gezogen. Für eine vergleichende Analyse werden auch altersentsprechende gesunde Kontrollpersonen in die Studie einbezogen. Die Forscher planen, an den Blutproben von Teilnehmern mit leichtem ARDS zu arbeiten. Die ersten Proben werden innerhalb von 72 Stunden nach Erfüllung der Diagnosekriterien für leichtes ARDS entnommen, danach alle 72 Stunden, bis sich die Teilnehmer von ARDS erholt haben oder von der Intensivstation entlassen wurden, oder drei Wochen nach der Aufnahme, je nachdem, was zuerst eintritt. Zur Serumvorbereitung werden 2 ml Blutproben in Sammelfläschchen entnommen und 60 Minuten bei Raumtemperatur gerinnen gelassen. Anschließend werden die Proben 10 Minuten lang bei 1.200 × g zentrifugiert, in Eppendorf-Röhrchen gesammelt, verschlossen und bei minus 80 Grad Celsius eingefroren, bis NMR-Experimente durchgeführt werden. Weitere 1D- und 2D-NMR-spektroskopische Techniken werden zur Charakterisierung und Quantifizierung verschiedener Stoffwechselkomponenten des Serums eingesetzt.

Diese Studie ist explorativer Natur, um die Kinetik der NMR-basierten Metabolomik in der ARDS-Population zu verstehen. In Anbetracht der Tatsache, dass etwa 20–25 % des leichten ARDS schließlich zu einem schweren ARDS fortschreiten, werden die Forscher insgesamt 120 Teilnehmer (einschließlich gesunder Teilnehmer) einbeziehen. Die Datenerfassung umfasst das demografische Profil, die klinischen Merkmale und den Schweregrad der Erkrankung. Der SOFA-Score (Sequential Organ Failure Assessment) zum Zeitpunkt der Aufnahme in die Studie, der klinische Verlauf während des Aufenthalts auf der Intensivstation und das Ergebnis der Teilnehmer werden durchgeführt.

Die NMR-Spektroskopie (800-MHz-Bruker) der Probe wird unter Verwendung eines externen Röhrchens durchgeführt, das Trimethylsilylpropansäure (TSP) und D2O enthält, um das Signal zu sperren. Plasma-/Serumproben werden aufgetaut und anschließend 5 Minuten lang bei 4 °C und 10.000 g zentrifugiert, um alle festen Rückstände zu entfernen. 450 μl jeder Probe werden gründlich mit 50 μl NMR-Puffer (1,5 MKH2PO4, 2 mM NaN3, 5,8 mM) gemischt mM Natrium-3-(trimethylsilyl)propionat-2,2,3,3-d4, D2O, pH 7,4) und die resultierende Lösung wird in 5-mm- oder 3-mm-NMR-Röhrchen überführt. Es werden alle eindimensionalen Spektren mit Wasserunterdrückung erhalten. Protonenspektren werden auf das TSP-Signal (δ=0,00) bezogen ppm). Die freien Induktionszerfälle (FIDs) werden vor der Fourier-Transformation mit Linienverbreiterung und Nullfüllung verarbeitet. Die erfassten Spektren werden manuell phasengesteuert; Grundlinie korrigiert und integriert mit TOPSPIN 2.1.

Alle NMR-Spektren werden mit dem TOPSIN 3-Paket verarbeitet und analysiert. Die automatische und überwachte Peakauswahl wird mit Amix durchgeführt und die Identifizierung der Metaboliten erfolgt mithilfe der Metaboanlayst- und BIOREFCODE-Metabolitendatenbank. Es werden standardmäßige statistische überwachte und unbeaufsichtigte multivariate Analysen (PCA und PLSDA) durchgeführt.

Metaboliten in den 1H-NMR-Spektren von Serumproben werden mithilfe der 1D-, 2D-, HMDB- und BMRB-Datenbank zugeordnet. Überlappende Resonanzen kleiner Metaboliten, die im 1D-Spektrum vorhanden sind, werden durch die Verwendung von 2D-Spektren bestätigt, einschließlich heteronuklearer Einzelquantenkorrelation (HSQC), Korrelationsspektroskopie (COSY), Gesamtkorrelationsspektroskopie (TOCSY), J-aufgelöster (JRES) und menschlicher Metabolomdatenbank sowie biologischer Magnetik Datenbank der Resonanzbank (BMRB).