Kohdunkaulan jatkuvan infektion ja onkogeneesin HPV-immunologiset markkerit (HPVImmuno)

Tämän tutkimuksen päämääränä on analysoida isäntätekijöitä, mukaan lukien virusspesifinen immuniteetti ja HPV:hen liittyvät parametrit, jotka vaikuttavat levyepiteliaalisen leesion (SIL) puhkeamiseen ja etenemiseen, jotta voidaan määritellä riskin kerrostuminen ja räätälöidä hoitoa, kehittää laajasti saatavilla olevaa ja ei-syötävää. -invasiiviset immunoscore-testit, joilla on korkea ennustearvo.

Levyepiteliaalisen leesion (H SIL) eteneminen 2 vuoden kohdalla naisilla, joilla on epänormaali papa-näyte, arvioidaan myös (ensisijainen päätepiste) ja immuuniisäntäprofiili HPV:tä ehkäisevän ja terapeuttisen rokotuksen jälkeen, naisilla, joilla on levyepiteelivaurioita ja joilla on infektion pysyvyys analysoidaan (toissijainen päätepiste).

Analysoimme potilaat, joille on otettu prospektiivisesti epänormaali papa-kokeilu kuuden kuukauden välein kahden vuoden ajan diagnoosin jälkeen. Joka ajankohtana kolposkopian aikana kerätään perifeeristä verta (30 ml) ja kohdunkaulan näytteitä (emättimen pesu, kohdunkaulan biopsia ja papa-näyte) paikallisen ja perifeerisen immuunivasteen karakterisoimiseksi. Viruskuorma, HPV-integraatio arvioidaan sytologisista ja kudosnäytteistä, jotka on otettu potilailta diagnoosin ja/tai parantavan leikkauksen yhteydessä.

Toissijaisia ​​päätepisteitä varten otamme mukaan potilaat, joilla on vahvistettu HPV-infektio ja jotka saavat terapeuttisen ja profylaktisen HPV-rokotteen. Rokotus suoritetaan välittömästi HPV-leesion diagnoosin jälkeen. Seurantaohjelma sisältää kolposkopian kuuden kuukauden välein 2 vuoden ajan. Analysoimme HPV-spesifisen immuunivasteen kuuden kuukauden välein sekä viruskuorman ja HPV-integraation diagnoosin yhteydessä ja seurannan lopussa.

Antigeenispesifisen proliferatiivisen vasteen arvioimiseksi PBMC:itä stimuloidaan kolmena rinnakkaisena 96-kuoppaisilla pyöreäpohjaisilla levyillä HPV-16- ja -18-antigeenien L1-, E6-, E7-proteiineilla ja ihmisen aktiinipeptidipoolilla 7 päivän ajan. Viljelyalusta oli RPMI 1640 täydennettynä 2 mM L-glutamiinilla, 100 U/ml penisilliiniä ja 100 µg/ml streptomysiiniliuosta, 10 % lämpöinaktivoitua FBS:ää, 1 mM natriumpyruvaattia, 100 µM ei-välttämättömiä aminohappoja ja 50 µM. -Merkaptoetanoli. Viljelyn jälkeen solut pestään, värjätään Live/Dead Fixable Violet Dye -värillä) ja sen jälkeen CD3:lla, CD4:llä, CD8:lla, CD25:llä, CD278:lla (ICOS). Lopuksi solut pestään ja suspendoidaan uudelleen PBS:ään, joka sisältää 1 % paraformaldehydiä.

Solujen lisääntymisindeksi (CPI) antigeenispesifisille laajentuneille T-soluille määritetään vähentämällä CD25+ICOS+ CD3+CD4+:n tai CD3+CD8+:n prosenttiosuus, joka havaitaan PBMC:ssä, joka on inkuboitu aktiinipeptidien kanssa, CD25+ICOS+ T-solujen prosenttiosuudesta. HPV-peptidien kanssa inkuboiduissa PBMC-soluissa havaittuja alaryhmiä. CPI <1,5 % katsotaan negatiiviseksi, kun taas arvo ≥ 1,5 % katsotaan positiiviseksi.

Virtaussytometria-analyysit suoritettiin FACS Canto II -virtaussytometrillä ja BD DIVA -ohjelmistolla.

HPV:hen liittyvien piirteiden analysoinnissa käytetään molekyylitason lähestymistapoja. HPV-DNA uutetaan biopsioista ja vaurionäytteistä automaattisilla järjestelmillä kudosten spesifisen lyysikäsittelyn jälkeen.

HPV-DNA kvantifioidaan sitten käyttämällä reaaliaikaista PCR:ää, joka on spesifinen L1/E2- ja E6-alueille; yksityiskohtaisesti käytetään L1-geenin MY 09/11 -fragmenttia. Tulokset ilmaistaan ​​kopioiden lukumääränä/100 000 solua ja normalisoidaan käyttämällä taloudenhoitogeeniä.

Integroituneen tai episomaalisen HPV-DNA:n differentiaaliseen kvantifiointiin käytetään spesifistä standardoitua järjestelmää ORF E2:n ja E6:n monistamiseksi.