A méhnyak perzisztens fertőzésének és onkogenezisének HPV immunológiai markerei (HPVImmuno)

Ennek a tanulmánynak a végpontja a gazdatényezők elemzése, beleértve a vírusspecifikus immunitást és a HPV-vel kapcsolatos paramétereket, amelyek befolyásolják a laphám intraepiteliális lézió (SIL) kialakulását és progresszióját, annak érdekében, hogy meghatározzuk a kockázati rétegződést és a kezelés testreszabását, széles körben hozzáférhető és nem. -invazív assays immunoscore magas prediktív értékkel.

A laphám intraepiteliális lézió (H SIL) progresszióját 2 éves korban abnormális pap-kenetben szenvedő nőknél (elsődleges végpont) és az immungazdaprofilt is értékelni fogják a HPV elleni profilaktikus és terápiás vakcinázás után, laphám intraepiteliális léziókban és a fertőzés perzisztenciáját elemzik (másodlagos végpont).

A kóros papa-kenettel prospektívan bevont betegeket félévente, a diagnózist követő két évig elemezzük. A kolposzkópia során minden időpontban perifériás vért (30 ml) és méhnyakmintákat (hüvelymosás, méhnyak biopszia és pap-kenet) gyűjtenek a helyi és perifériás immunválasz jellemzésére. A vírusterhelést és a HPV integrációt a betegektől a diagnózis és/vagy a gyógyító műtét idején vett citológiai és szövetmintákon értékelik.

A másodlagos végpontokhoz igazolt HPV-fertőzésben szenvedő, terápiás és profilaktikus HPV-oltásban részesülő betegeket vonunk be. Az oltást közvetlenül a HPV-lézió diagnosztizálása után kell elvégezni. A nyomon követési program magában foglalja a kolposzkópiát hathavonta 2 éven keresztül. Félévente elemezzük a HPV-specifikus immunválaszt, valamint a vírusterhelést és a HPV-integrációt a diagnózis idején és a követés végén.

Az antigén-specifikus proliferatív válasz értékeléséhez a PBMC-ket három párhuzamosban stimulálják 96 lyukú kerek fenekű lemezeken a HPV-16 és -18 L1, E6, E7 antigénekkel és humán aktin peptidkészletekkel 7 napon keresztül. A táptalaj RPMI 1640 volt, kiegészítve 2 mM L-glutaminnal, 100 U/ml penicillinnel és 100 µg/ml sztreptomicin-oldattal, 10% hővel inaktivált FBS-sel, 1 mM nátrium-piruváttal, 100 µM nem esszenciális aminosavakkal és 50 µM. -Merkaptoetanol. A tenyésztés után a sejteket mossuk, élő/halott fixálható ibolya festékkel, majd CD3, CD4, CD8, CD25, CD278 (ICOS) festékkel festjük. Végül a sejteket mossuk, és 1% paraformaldehidet tartalmazó PBS-ben újraszuszpendáljuk.

Az antigén-specifikus kiterjesztett T-sejtek sejtszaporodási indexét (CPI) úgy határozzák meg, hogy levonják az aktinpeptidekkel inkubált PBMC-ben kimutatott CD25+ICOS+ CD3+CD4+ vagy CD3+CD8+ százalékát a CD25+ICOS+ T-sejt százalékából. HPV-peptidekkel inkubált PBMC-ben kimutatott alcsoportok. Az 1,5% alatti CPI negatívnak, míg az 1,5% feletti érték pozitívnak minősül.

Az áramlási citometriás elemzéseket FACS Canto II áramlási citométerrel és BD DIVA szoftverrel végeztük.

A HPV-vel kapcsolatos jellemzők elemzéséhez molekuláris megközelítéseket kell alkalmazni. A HPV DNS-t a biopsziákból és a léziókból vett tamponokból automatizált rendszerekkel vonják ki a szövetek specifikus líziskezelése után.

A HPV DNS-t ezután az L1/E2 és E6 régiókra specifikus valós idejű PCR segítségével kvantifikáljuk; részletesen az L1 gén MY 09/11 fragmentumát használjuk. Az eredményeket a másolatok száma/100 000 sejtként fejezzük ki, és egy háztartási gén segítségével normalizáljuk.

Az integrált vagy episzomális HPV DNS differenciális mennyiségi meghatározásához az ORF E2 és E6 amplifikálására szolgáló specifikus szabványos rendszert használnak.