ВПЧ-иммунологические маркеры персистирующей инфекции шейки матки и онкогенеза (HPVImmuno)

Конечной целью данного исследования является анализ факторов хозяина, в том числе вирусспецифического иммунитета и параметров, связанных с ВПЧ, влияющих на возникновение и прогрессирование плоскоклеточного интраэпителиального поражения (SIL), с целью определения стратификации риска и подбора лечения, разработки широко доступных и безопасных методов лечения. -инвазивный иммуноанализ с высокой прогностической ценностью.

Также будет оцениваться прогрессирование плоскоклеточного интраэпителиального поражения (H SIL) через 2 года у женщин с аномальными мазками Папаниколау (первичная конечная точка) и профиль иммунного хозяина после профилактической и терапевтической вакцинации против ВПЧ, у женщин с плоскоклеточными интраэпителиальными поражениями и с будет проанализирована персистенция инфекции (вторичная конечная точка).

Мы будем анализировать пациентов, поступивших проспективно с аномальными мазками каждые шесть месяцев в течение двух лет после постановки диагноза. В каждый момент времени во время кольпоскопии будут собираться образцы периферической крови (30 мл) и шейки матки (вагинальные смывы, биопсия шейки матки и мазок Папаниколау) для характеристики местного и периферического иммунного ответа. Вирусная нагрузка, интеграция ВПЧ будут оцениваться на цитологических образцах и образцах тканей, полученных от пациентов во время постановки диагноза и/или лечебной операции.

Для вторичных конечных точек мы будем включать пациентов с подтвержденной инфекцией ВПЧ, проходящих терапевтическую и профилактическую вакцинацию против ВПЧ. Вакцинация будет проведена сразу после диагностики поражения ВПЧ. Программа диспансерного наблюдения предполагает кольпоскопию каждые шесть месяцев в течение 2 лет. Мы будем анализировать ВПЧ-специфический иммунный ответ каждые шесть месяцев, а также вирусную нагрузку и интеграцию ВПЧ на момент постановки диагноза и в конце наблюдения.

Для оценки антигенспецифического пролиферативного ответа РВМС будут стимулировать трижды в 96-луночных круглодонных планшетах антигенами L1, E6, E7 белков HPV-16 и -18 и пулами пептида актина человека в течение 7 дней. Культуральная среда представляла собой RPMI 1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 ед/мл раствора пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, 10% инактивированного нагреванием FBS, 1 мМ пирувата натрия, 100 мкМ заменимых аминокислот и 50 мкМ 2. -Меркаптоэтанол. После культивирования клетки промывают, окрашивают живым/мертвым фиксируемым фиолетовым красителем, а затем CD3, CD4, CD8, CD25, CD278 (ICOS). Наконец, клетки промывают и ресуспендируют в 1% параформальдегиде PBS.

Индекс пролиферации клеток (CPI) для антигенспецифических расширенных Т-клеток будет определяться путем вычитания процента CD25+ICOS+ CD3+CD4+ или CD3+CD8+, обнаруженного в РВМС, инкубированных с актиновыми пептидами, из процента CD25+ICOS+ Т-клеток. подгруппы, обнаруженные в РВМС, инкубированных с пептидами ВПЧ. ИПЦ <1,5% будет считаться отрицательным, а значение ≥1,5% — положительным.

Анализы проточной цитометрии выполняли с помощью проточного цитометра FACS Canto II и программного обеспечения BD DIVA.

Для анализа особенностей ВПЧ будут использоваться молекулярные подходы. ДНК ВПЧ будет извлекаться из биоптатов и мазков с пораженных участков с использованием автоматизированных систем после специфической обработки лизисом тканей.

Затем ДНК ВПЧ будет определена количественно с использованием ПЦР в реальном времени, специфичной для регионов L1/E2 и E6; подробно будет использован фрагмент MY 09/11 гена L1. Результаты будут выражены как количество копий на 100 000 клеток и нормализованы с использованием гена домашнего хозяйства.

Для дифференциального количественного определения интегрированной или эписомальной ДНК ВПЧ будет использоваться специальная стандартизированная система для амплификации ORF E2 и E6.