Marcadores inmunológicos del VPH de infección persistente cervical y oncogénesis (HPVImmuno)

El objetivo final de este estudio es analizar los factores del huésped, incluida la inmunidad específica del virus y los parámetros relacionados con el VPH que influyen en la aparición y progresión de la lesión intraepitelial escamosa (SIL), para definir la estratificación del riesgo y adaptar el tratamiento, desarrollando ampliamente accesible y no -Ensayos invasivos de inmunoscore con alto valor predictivo.

También se evaluará la progresión de la lesión intraepitelial escamosa (H SIL) a los 2 años en mujeres con prueba de Papanicolaou anormal (criterio de valoración principal) y el perfil inmunológico del huésped después de la vacunación profiláctica y terapéutica anti-VPH, en mujeres con lesiones intraepiteliales escamosas y con Se analizará la persistencia de la infección (criterio de valoración secundario).

Analizaremos a los pacientes, inscritos prospectivamente con una prueba de Papanicolaou anormal cada seis meses hasta dos años después del diagnóstico. En cada momento, durante la colposcopia, se recolectarán muestras de sangre periférica (30 ml) y de cuello uterino (lavado vaginal, biopsia cervical y prueba de Papanicolaou) para la caracterización de la respuesta inmune local y periférica. La carga viral y la integración del VPH se evaluarán en muestras citológicas y de tejido obtenidas de los pacientes en el momento del diagnóstico y/o cirugía curativa.

Para los criterios de valoración secundarios, inscribiremos a pacientes con infección por VPH confirmada, sometidos a vacunación terapéutica y profiláctica contra el VPH. La vacunación se realizará inmediatamente después del diagnóstico de la lesión por VPH. El programa de seguimiento implica una colposcopia cada seis meses durante 2 años. Analizaremos la respuesta inmune específica del VPH cada seis meses, y la carga viral y la integración del VPH en el momento del diagnóstico y al final del seguimiento.

Para evaluar la respuesta proliferativa específica de antígeno, las PBMC se estimularán por triplicado en placas de fondo redondo de 96 pocillos con antígenos L1, E6, proteínas E7 de HPV-16 y -18 y grupos de péptidos de actina humana durante 7 días. El medio de cultivo fue RPMI 1640 suplementado con L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/mL y solución de estreptomicina 100 µg/mL, 10% de FBS inactivado por calor, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales 100 µM y 2 50 µM. -Mercaptoetanol. Después del cultivo, las células se lavarán, se teñirán con tinte violeta fijable vivo/muerto) y posteriormente con CD3, CD4, CD8, CD25, CD278 (ICOS). Finalmente, las células se lavarán y resuspenderán en PBS paraformaldehído al 1%.

Se determinará un índice de proliferación celular (IPC) para células T expandidas específicas de antígeno restando el porcentaje de CD25+ICOS+ CD3+CD4+ o CD3+CD8+ detectado en PBMC incubadas con péptidos de actina del porcentaje de células T CD25+ICOS+. subconjuntos detectados en PBMC incubadas con péptidos de VPH. Un IPC <1,5% se considerará negativo mientras que un valor ≥1,5% se considerará positivo.

Los análisis de citometría de flujo se realizaron con un citómetro de flujo FACS Canto II y el software BD DIVA.

Para el análisis de las características relacionadas con el VPH se utilizarán enfoques moleculares. El ADN del VPH se extraerá de biopsias e hisopos de lesiones mediante sistemas automatizados después de un tratamiento de lisis específico para tejidos.

Luego, el ADN del VPH se cuantificará mediante PCR en tiempo real específica para las regiones L1/E2 y E6; en detalle se utilizará el fragmento MY 09/11 del gen L1. Los resultados se expresarán como el número de copias/100.000 células y se normalizarán utilizando un gen de mantenimiento.

Para la cuantificación diferencial del ADN del VPH integrado o episomal se utilizará un sistema estandarizado específico para la amplificación de ORF E2 y E6.