HPV-immunologiske markører for cervikal vedvarende infeksjon og onkogenese (HPVImmuno)

Sluttpunktet for denne studien er å analysere vertsfaktorer, inkludert virusspesifikk immunitet og HPV-relaterte parametere som påvirker utbruddet og progresjonen av squamous intraepitelial lesjon (SIL), for å definere risikostratifisering og skreddersy behandling, utvikle allment tilgjengelig og ikke -invasive analyser immunscore med høy prediktiv verdi.

Progresjonen av plateepiteliell lesjon (H SIL) ved 2 år hos kvinner med unormal celleprøve vil også bli evaluert (primært endepunkt) og immunvertsprofilen etter anti-HPV profylaktisk og terapeutisk vaksinasjon, hos kvinner med plateepiteliale lesjoner og med persistens av infeksjon vil bli analysert (sekundært endepunkt).

Vi vil analysere pasientene, innrullert prospektivt med unormal celleprøve hver sjette måned opp til to år etter diagnosen. Ved hvert tidspunkt, under kolposkopi, vil perifert blod (30 ml) og livmorhalsprøver (vaginal vask, livmorhalsbiopsi og pap-utstryk) samles inn for karakterisering av lokal og perifer immunrespons. Viral belastning, HPV-integrasjon vil bli vurdert på cytologiske prøver og vevsprøver innhentet fra pasientene på tidspunktet for diagnose og/eller kurativ kirurgi.

For de sekundære endepunktene vil vi registrere pasienter med bekreftet HPV-infeksjon, som gjennomgår terapeutisk og profylaktisk HPV-vaksinasjon. Vaksinasjonen vil bli utført umiddelbart etter HPV-lesjonsdiagnose. Oppfølgingsprogram innebærer kolposkopi hver sjette måned i 2 år. Vi vil analysere HPV-spesifikk immunrespons hvert halvår, og virusmengde og HPV-integrasjon ved diagnosetidspunktet og ved slutten av oppfølgingen.

For å evaluere antigenspesifikk proliferativ respons, vil PBMC-er bli stimulert i tre eksemplarer i 96-brønners rundbunnede plater med antigener L1, E6, E7-proteiner av HPV-16 og -18 og humane Actin-peptidpooler i 7 dager. Kulturmediet var RPMI 1640 supplert med 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penicillin og 100 µg/ml streptomycinløsning, 10 % varmeinaktivert FBS, 1 mM natriumpyruvat, 100 µM ikke-essensielle 52 aminosyrer, og µM aminosyrer. - Merkaptoetanol. Etter dyrking vil cellene bli vasket, farget med Live/Dead Fixable Violet Dye) og deretter med CD3, CD4, CD8, CD25, CD278 (ICOS). Til slutt vil cellene vaskes og resuspenderes i PBS 1% paraformaldehyd.

En celleproliferasjonsindeks (CPI) for antigenspesifikke utvidede T-celler vil bli bestemt ved å trekke fra prosentandelen av CD25+ICOS+ CD3+CD4+ eller CD3+CD8+ påvist i PBMC inkubert med aktinpeptider fra prosentandelen av CD25+ICOS+ T-celler undersett påvist i PBMC inkubert med HPV-peptider. En KPI <1,5 % vil bli ansett som negativ, mens en verdi ≥1,5 % vil regnes som positiv.

Flowcytometrianalyser ble utført med et FACS Canto II flowcytometer og BD DIVA-programvare.

For analyse av HPV-relaterte egenskaper vil molekylære tilnærminger bli brukt. HPV-DNA vil bli ekstrahert fra biopsier og lesjonsprøver ved hjelp av automatiserte systemer etter spesifikk lyseringsbehandling for vev.

HPV DNA vil deretter kvantifiseres ved bruk av sanntids PCR spesifikk for L1/E2 og E6 regioner; i detalj MY 09/11 fragment av L1 genet vil bli brukt. Resultatene vil bli uttrykt som antall kopier/100.000 celler og normalisert ved hjelp av et husholdningsgen.

For differensiell kvantifisering av integrert eller episomalt HPV DNA vil et spesifikt standardisert system for amplifikasjon av ORF E2 og E6 bli brukt.