HPV-immunologische markers van cervicale persistente infectie en oncogenese (HPVImmuno)

Het eindpunt van deze studie is het analyseren van gastheerfactoren, waaronder virusspecifieke immuniteit en HPV-gerelateerde parameters die het ontstaan ​​en de progressie van plaveiselcelintra-epitheliale laesie (SIL) beïnvloeden, om zo risicostratificatie te definiëren en de behandeling op maat te maken, en breed toegankelijke en niet-specifieke behandeling te ontwikkelen. -invasieve testen immunoscore met hoge voorspellende waarde.

De progressie van plaveiselcel-intra-epitheliale laesie (H SIL) na 2 jaar bij vrouwen met een abnormaal uitstrijkje zal ook worden geëvalueerd (primair eindpunt) en het immuungastheerprofiel na profylactische en therapeutische anti-HPV-vaccinatie, bij vrouwen met plaveiselcel-intra-epitheliale laesies en met de persistentie van de infectie zal worden geanalyseerd (secundair eindpunt).

We zullen de patiënten analyseren die prospectief zijn ingeschreven met een abnormaal uitstrijkje, elke zes maanden tot twee jaar na de diagnose. Op elk tijdstip zullen tijdens colposcopie perifeer bloed (30 ml) en cervicale monsters (vaginaal wassen, cervicale biopsie en uitstrijkje) worden verzameld voor de karakterisering van de lokale en perifere immuunrespons. Virale belasting en HPV-integratie zullen worden beoordeeld op cytologische en weefselmonsters verkregen van de patiënten op het moment van diagnose en/of curatieve chirurgie.

Voor de secundaire eindpunten zullen we patiënten inschrijven met een bevestigde HPV-infectie, die therapeutische en profylactische HPV-vaccinatie ondergaan. De vaccinatie zal onmiddellijk na de diagnose van de HPV-laesie worden uitgevoerd. Het vervolgprogramma impliceert een zesmaandelijkse colposcopie gedurende 2 jaar. We zullen elke zes maanden de HPV-specifieke immuunrespons analyseren, evenals de virale belasting en HPV-integratie op het moment van diagnose en aan het einde van de follow-up.

Om de antigeenspecifieke proliferatieve respons te evalueren, zullen PBMC's in drievoud worden gestimuleerd in platen met ronde bodem van 96 putjes met antigenen L1-, E6-, E7-eiwitten van HPV-16 en -18 en menselijke actinepeptidepools gedurende 7 dagen. Het kweekmedium was RPMI 1640 aangevuld met 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicilline en 100 µg/ml streptomycine-oplossing, 10% door hitte geïnactiveerde FBS, 1 mM natriumpyruvaat, 100 µM niet-essentiële aminozuren en 50 µM2 -Mercapto-ethanol. Na de kweek worden de cellen gewassen, gekleurd met Live/Dead Fixable Violet Dye en vervolgens met CD3, CD4, CD8, CD25, CD278 (ICOS). Ten slotte worden de cellen gewassen en geresuspendeerd in PBS 1% paraformaldehyde.

Een celproliferatie-index (CPI) voor antigeenspecifieke geëxpandeerde T-cellen zal worden bepaald door het percentage CD25+ICOS+ CD3+CD4+ of CD3+CD8+ gedetecteerd in PBMC geïncubeerd met actinepeptiden af ​​te trekken van het percentage CD25+ICOS+ T-cellen. subsets gedetecteerd in PBMC geïncubeerd met HPV-peptiden. Een CPI <1,5% wordt als negatief beschouwd, terwijl een waarde ≥1,5% als positief wordt beschouwd.

Flowcytometrieanalyses werden uitgevoerd met een FACS Canto II flowcytometer en BD DIVA-software.

Voor de analyse van HPV-gerelateerde kenmerken zullen moleculaire benaderingen worden gebruikt. HPV-DNA zal met behulp van geautomatiseerde systemen worden geëxtraheerd uit biopsieën en laesieswabs na specifieke lysebehandeling van weefsels.

HPV-DNA zal vervolgens worden gekwantificeerd met behulp van real-time PCR specifiek voor L1/E2- en E6-regio's; in detail zal het MY 09/11-fragment van het L1-gen worden gebruikt. De resultaten zullen worden uitgedrukt als het aantal kopieën/100.000 cellen en worden genormaliseerd met behulp van een huishoudgen.

Voor de differentiële kwantificering van geïntegreerd of episomaal HPV-DNA zal een specifiek gestandaardiseerd systeem voor de amplificatie van ORF E2 en E6 worden gebruikt.