HPV-immunologiska markörer för cervikal persistent infektion och onkogenes (HPVImmuno)

Slutpunkten för denna studie är att analysera värdfaktorer, inklusive virusspecifik immunitet och HPV-relaterade parametrar som påverkar uppkomsten och progressionen av skivepitelskada (SIL), för att definiera riskstratifiering och skräddarsy behandling, utveckla allmänt tillgänglig och icke -invasiva analyser immunpoäng med högt prediktivt värde.

Progressionen av skivepitelskada (H SIL) vid 2 år hos kvinnor med onormalt cellprov kommer också att utvärderas (primärt slutpunkt) och immunvärdens profil efter anti-HPV profylaktisk och terapeutisk vaccination, hos kvinnor med skvamösa intraepiteliala lesioner och med infektionens persistens kommer att analyseras (sekundär slutpunkt).

Vi kommer att analysera patienterna, prospektivt inskrivna med onormalt cellprov var sjätte månad upp till två år efter diagnos. Vid varje tidpunkt, under kolposkopi, kommer perifert blod (30 ml) och cervikala prover (vaginal tvätt, cervikal biopsi och pap-utstryk) att samlas in för karakterisering av lokalt och perifert immunsvar. Virusbelastning, HPV-integration kommer att bedömas på cytologiska och vävnadsprover som erhållits från patienterna vid tidpunkten för diagnos och/eller kurativ kirurgi.

För de sekundära effektmåtten kommer vi att registrera patienter med bekräftad HPV-infektion, som genomgår terapeutisk och profylaktisk HPV-vaccination. Vaccinationen kommer att utföras omedelbart efter HPV-lesionsdiagnos. Uppföljningsprogram innebär kolposkopi var sjätte månad i 2 år. Vi kommer att analysera HPV-specifikt immunsvar var sjätte månad, och virusmängd och HPV-integration vid tidpunkten för diagnos och i slutet av uppföljningen.

För att utvärdera antigenspecifikt proliferativt svar kommer PBMC:er att stimuleras i tre exemplar i 96-brunnars rundbottnade plattor med antigenerna L1, E6, E7 proteiner av HPV-16 och -18 och humana Actin-peptidpooler under 7 dagar. Odlingsmedium var RPMI 1640 kompletterat med 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penicillin och 100 µg/ml streptomycinlösning, 10 % värmeinaktiverad FBS, 1 mM natriumpyruvat, 100 µM icke-essentiella 52 aminosyror och 52 µM aminosyror - Merkaptoetanol. Efter odling kommer cellerna att tvättas, färgas med Live/Dead Fixable Violet Dye) och därefter med CD3, CD4, CD8, CD25, CD278 (ICOS). Slutligen kommer cellerna att tvättas och återsuspenderas i PBS 1% paraformaldehyd.

Ett cellproliferationsindex (CPI) för antigenspecifika expanderade T-celler kommer att bestämmas genom att subtrahera procentandelen CD25+ICOS+ CD3+CD4+ eller CD3+CD8+ detekterad i PBMC inkuberad med aktinpeptider från procentandelen CD25+ICOS+ T-cell delmängder detekterade i PBMC inkuberade med HPV-peptider. En KPI <1,5 % kommer att betraktas som negativ medan ett värde ≥1,5 % kommer att betraktas som positivt.

Flödescytometrianalyser utfördes med en FACS Canto II flödescytometer och BD DIVA-mjukvara.

För analys av HPV-relaterade egenskaper kommer molekylära metoder att användas. HPV-DNA kommer att extraheras från biopsier och lesionsprover med hjälp av automatiserade system efter specifik lysbehandling av vävnader.

HPV-DNA kommer sedan att kvantifieras med användning av realtids-PCR som är specifik för L1/E2- och E6-regioner; i detalj MY 09/11-fragmentet av L1-genen kommer att användas. Resultaten kommer att uttryckas som antal kopior/100 000 celler och normaliseras med hjälp av en hushållsgen.

För differentiell kvantifiering av integrerat eller episomalt HPV-DNA kommer ett specifikt standardiserat system för amplifiering av ORF E2 och E6 att användas.