Immunologische HPV-Marker für persistierende Gebärmutterhalsinfektionen und Onkogenese (HPVImmuno)

Der Endpunkt dieser Studie ist die Analyse von Wirtsfaktoren, einschließlich virusspezifischer Immunität und HPV-bezogener Parameter, die den Beginn und das Fortschreiten von Plattenepithelläsionen (Squamous Intraepithelial Läsion, SIL) beeinflussen, um eine Risikostratifizierung und eine maßgeschneiderte Behandlung zu definieren, die allgemein zugänglich und nicht zugänglich ist -Invasive Assays, Immunscore mit hohem Vorhersagewert.

Das Fortschreiten der intraepithelialen Plattenepithelläsion (H SIL) nach 2 Jahren bei Frauen mit abnormalem Pap-Abstrich wird ebenfalls bewertet (primärer Endpunkt) und das Immunwirtsprofil nach prophylaktischer und therapeutischer Anti-HPV-Impfung bei Frauen mit intraepithelialen Plattenepithelläsionen und mit Die Persistenz der Infektion wird analysiert (sekundärer Endpunkt).

Wir werden die prospektiv aufgenommenen Patienten mit auffälligem Pap-Abstrich alle sechs Monate bis zu zwei Jahre nach der Diagnose analysieren. Zu jedem Zeitpunkt während der Kolposkopie werden peripheres Blut (30 ml) und Gebärmutterhalsproben (Vaginalspülung, Gebärmutterhalsbiopsie und Pap-Abstrich) zur Charakterisierung der lokalen und peripheren Immunantwort entnommen. Die Viruslast und die HPV-Integration werden anhand von Zytologie- und Gewebeproben beurteilt, die den Patienten zum Zeitpunkt der Diagnose und/oder der kurativen Operation entnommen wurden.

Für die sekundären Endpunkte werden wir Patienten mit bestätigter HPV-Infektion einschließen, die sich einer therapeutischen und prophylaktischen HPV-Impfung unterziehen. Die Impfung wird unmittelbar nach der Diagnose einer HPV-Läsion durchgeführt. Das Nachsorgeprogramm umfasst eine Kolposkopie alle sechs Monate über einen Zeitraum von zwei Jahren. Wir analysieren alle sechs Monate die HPV-spezifische Immunantwort sowie die Viruslast und die HPV-Integration zum Zeitpunkt der Diagnose und am Ende der Nachuntersuchung.

Um die Antigen-spezifische proliferative Reaktion zu bewerten, werden PBMCs in dreifacher Ausfertigung in 96-Well-Rundbodenplatten mit den Antigenen L1, E6, E7-Proteinen von HPV-16 und -18 und menschlichen Actin-Peptid-Pools für 7 Tage stimuliert. Das Kulturmedium war RPMI 1640, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycinlösung, 10 % hitzeinaktiviertem FBS, 1 mM Natriumpyruvat, 100 µM nicht-essentieller Aminosäuren und 50 µM 2 -Mercaptoethanol. Nach der Kultur werden die Zellen gewaschen, mit Live/Dead Fixable Violet Dye und anschließend mit CD3, CD4, CD8, CD25, CD278 (ICOS) gefärbt. Abschließend werden die Zellen gewaschen und in PBS 1 % Paraformaldehyd resuspendiert.

Ein Zellproliferationsindex (CPI) für antigenspezifische expandierte T-Zellen wird ermittelt, indem der Prozentsatz an CD25+ICOS+ CD3+CD4+ oder CD3+CD8+, der in mit Aktinpeptiden inkubierten PBMC nachgewiesen wurde, vom Prozentsatz an CD25+ICOS+ T-Zellen abgezogen wird Untergruppen, die in mit HPV-Peptiden inkubierten PBMC nachgewiesen wurden. Ein CPI <1,5 % gilt als negativ, während ein Wert ≥1,5 % als positiv gilt.

Durchflusszytometrieanalysen wurden mit einem FACS Canto II-Durchflusszytometer und der BD DIVA-Software durchgeführt.

Für die Analyse HPV-bezogener Merkmale werden molekulare Ansätze verwendet. HPV-DNA wird aus Biopsien und Läsionsabstrichen mithilfe automatisierter Systeme nach einer spezifischen Lysebehandlung für Gewebe extrahiert.

Anschließend wird die HPV-DNA mittels Echtzeit-PCR spezifisch für die Regionen L1/E2 und E6 quantifiziert; Im Detail wird das MY 09/11-Fragment des L1-Gens verwendet. Die Ergebnisse werden als Anzahl der Kopien/100.000 Zellen ausgedrückt und mithilfe eines Housekeeping-Gens normalisiert.

Für die differenzielle Quantifizierung integrierter oder episomaler HPV-DNA wird ein spezifisches standardisiertes System zur Amplifikation von ORF E2 und E6 verwendet.