Marqueurs immunologiques HPV de l'infection cervicale persistante et de l'oncogenèse (HPVImmuno)

Le point final de cette étude est d'analyser les facteurs de l'hôte, y compris l'immunité spécifique au virus et les paramètres liés au VPH influençant l'apparition et la progression de la lésion intraépithéliale squameuse (SIL), afin de définir la stratification du risque et d'adapter le traitement, en développant largement accessible et non -des tests invasifs immunoscore à haute valeur prédictive.

La progression de la lésion épidermoïde intraépithéliale (H SIL) à 2 ans chez les femmes présentant un test Pap anormal sera également évaluée (critère principal) ainsi que le profil de l'hôte immunitaire après vaccination prophylactique et thérapeutique anti-HPV, chez les femmes présentant des lésions épidermoïdes intraépithéliales et avec la persistance de l'infection sera analysée (critère secondaire).

Nous analyserons les patients, recrutés prospectivement avec un test Pap anormal tous les six mois jusqu'à deux ans après le diagnostic. À chaque instant, pendant la colposcopie, des échantillons de sang périphérique (30 ml) et cervicaux (lavage vaginal, biopsie cervicale et test Pap) seront collectés pour la caractérisation de la réponse immunitaire locale et périphérique. La charge virale et l'intégration du VPH seront évaluées sur des échantillons cytologiques et tissulaires obtenus auprès des patients au moment du diagnostic et/ou de la chirurgie curative.

Pour les critères d'évaluation secondaires, nous recruterons des patients avec une infection confirmée par le VPH, subissant une vaccination thérapeutique et prophylactique contre le VPH. La vaccination sera effectuée immédiatement après le diagnostic de la lésion HPV. Le programme de suivi implique une colposcopie tous les six mois pendant 2 ans. Nous analyserons la réponse immunitaire spécifique au VPH tous les six mois, ainsi que la charge virale et l'intégration du VPH au moment du diagnostic et à la fin du suivi.

Pour évaluer la réponse proliférative spécifique à l'antigène, les PBMC seront stimulées en triple dans des plaques à fond rond de 96 puits avec les antigènes L1, E6, E7 des protéines HPV-16 et -18 et des pools de peptides d'actine humaine pendant 7 jours. Le milieu de culture était du RPMI 1640 additionné de 2 mM de L-glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de solution de streptomycine, 10 % de FBS inactivé par la chaleur, 1 mM de pyruvate de sodium, 100 µM d'acides aminés non essentiels et 50 µM 2 -Mercaptoéthanol. Après la culture, les cellules seront lavées, colorées avec du colorant violet fixable Live/Dead) puis avec CD3, CD4, CD8, CD25, CD278 (ICOS). Enfin, les cellules seront lavées et remises en suspension dans du PBS 1% paraformaldéhyde.

Un indice de prolifération cellulaire (CPI) pour les lymphocytes T expansés spécifiques de l'antigène sera déterminé en soustrayant le pourcentage de CD25+ICOS+ CD3+CD4+ ou CD3+CD8+ détectés dans les PBMC incubées avec des peptides d'actine du pourcentage de lymphocytes T CD25+ICOS+. sous-ensembles détectés dans les PBMC incubés avec des peptides du VPH. Un IPC <1,5% sera considéré comme négatif tandis qu'une valeur ≥1,5% sera considérée comme positive.

Les analyses de cytométrie en flux ont été effectuées avec un cytomètre en flux FACS Canto II et le logiciel BD DIVA.

Pour l'analyse des caractéristiques liées au VPH, des approches moléculaires seront utilisées. L'ADN du VPH sera extrait des biopsies et des prélèvements de lésions à l'aide de systèmes automatisés après un traitement de lyse spécifique des tissus.

L'ADN du VPH sera ensuite quantifié à l'aide d'une PCR en temps réel spécifique aux régions L1/E2 et E6 ; en détail, le fragment MY 09/11 du gène L1 sera utilisé. Les résultats seront exprimés en nombre de copies/100 000 cellules et normalisés à l'aide d'un gène domestique.

Pour la quantification différentielle de l'ADN HPV intégré ou épisomique, un système standardisé spécifique pour l'amplification des ORF E2 et E6 sera utilisé.