Effet des cytokines dérivées de l'obésité sur le renouvellement des protéines et le métabolisme des glucides dans le muscle squelettique humain

Recrutement des sujets :

24 participants obèses (mais autrement en bonne santé) avec des niveaux élevés de cytokines et 24 sujets non obèses avec des niveaux de cytokines normaux seront recrutés. Suite à la première visite expérimentale (voir ci-dessous), les participants seront divisés en double aveugle en quatre groupes (n = 12). Dans des études antérieures utilisant des états inflammatoires de bas grade similaires où des thiazolidinediones ont été administrées, des différences significatives (P <0, 05) dans les processus à l'étude ont été observées avec des tailles de groupe de 10. Par conséquent, des tailles de groupe de 12 ont été sélectionnées pour tenir compte de l'abandon anticipé de 15 % observé dans les études à long terme. Les participants seront des hommes, du même âge (>55 ans), non-fumeurs, vivant un mode de vie sédentaire et non végétariens. Avant de participer à l'étude, tous les sujets subiront un examen médical et rempliront un questionnaire de santé général. Cela comprendra des mesures de la pression artérielle, de la fréquence cardiaque, de l'électrocardiogramme (ECG) à 12 dérivations, de la biochimie sanguine et d'un profil de coagulation sanguine. Pour les sujets non témoins, l'inclusion dans l'étude sera déterminée par des mesures du tour de taille (> 100 cm) et de l'état inflammatoire (sujets non obèses avec des taux plasmatiques de protéines C-réactives (CRP) < 1,35 μg.ml-1 et taux plasmatiques de facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα) < 3,3 pg.ml-1 et sujets obèses avec une CRP > 1,35 μg.ml-1 et TNFα > 4,1 pg.ml-1). Après une explication de l'étude et des procédures associées, un consentement écrit sera obtenu et les sujets informés qu'ils sont libres de se retirer à tout moment. Les sujets seront recrutés via des annonces dans la presse auprès de la population locale.

Essais expérimentaux :

Au début d'une étude de 12 semaines, la synthèse des protéines musculaires et la dégradation des protéines des jambes seront déterminées chez tous les sujets via l'administration d'isotopes stables de leucine et de phénylalanine en même temps qu'un clamp à insuline en deux étapes pour simuler le passage du jeûne au état fédéral. Cela établira les valeurs de référence pour ces mesures avant la période d'intervention de 12 semaines. Ces mesures seront réalisées en une seule visite avec l'exécution d'un protocole établi pour la détermination de la synthèse des protéines musculaires et de la dégradation des protéines des jambes. En résumé, pour y parvenir, les opérations suivantes seront effectuées : une biopsie musculaire basale de la cuisse sera obtenue, après quoi les concentrations sériques d'insuline seront maintenues aux niveaux de jeûne et une autre biopsie musculaire sera obtenue ; une fois prises, les concentrations d'insuline sérique seront élevées et des acides aminés mélangés seront administrés pour simuler l'alimentation, suivis de la prise d'une troisième et dernière biopsie musculaire. La prise de biopsies permettra de déterminer l'incorporation d'isotopes et ainsi la détermination de la synthèse des protéines musculaires et des taux de dégradation des protéines des jambes.

Suite à la première visite expérimentale, les sujets commenceront une période de traitement de 12 semaines de pioglitazone (30 mg•jour-1) ou d'un placebo, administré en double aveugle. Les sujets seront surveillés à intervalles réguliers tout au long de la période pour assurer la conformité et signaler les effets secondaires indésirables. Après 12 semaines d'administration du médicament ou du placebo, les sujets retourneront au laboratoire pour une répétition des mesures déterminées lors de la première visite expérimentale (synthèse des protéines musculaires et dégradation des protéines des jambes en réponse à une alimentation simulée). Les niveaux circulants de certaines cytokines seront en outre examinés dans des échantillons de sang prélevés sur des sujets au début des deux visites expérimentales (période d'intervention médicamenteuse avant et après 12 semaines), permettant ainsi une évaluation de tout changement associé entre les concentrations systémiques de cytokines et synthèse des protéines musculaires et dégradation des protéines des jambes.

Protocole d'étude:

L'étude comprend deux visites séparées par une période d'intervention médicamenteuse de 12 semaines. À chacune des deux visites, la synthèse des protéines musculaires et les taux de dégradation des protéines des jambes en réponse à une alimentation simulée doivent être évalués à l'aide d'un protocole expérimental établi décrit ci-dessous :

Les sujets seront invités à s'abstenir de boire de l'alcool et de faire de l'exercice pendant 48 heures avant chaque visite expérimentale et à arriver le matin de la visite expérimentale à jeun. Les sujets seront invités à se reposer en position semi-couchée tandis qu'une canule est insérée rétrograde dans une veine superficielle sur la surface dorsale de la main non dominante pour le prélèvement sanguin. La main sera maintenue dans une chaufferie (température de l'air 50-55°C) pour artérialiser le drainage veineux de la main. Une canule sera placée dans une veine antécubitale de chaque avant-bras pour l'infusion d'insuline, d'octréotide, de glucose, d'acides aminés et d'infusions d'isotopes stables de leucine et de phénylalanine pour simuler l'alimentation de manière précise ; un cathéter placé dans la veine fémorale permettra, en conjonction avec des prélèvements de sang veineux artérialisé (A-V), un prélèvement de sang artériel et veineux à travers la jambe. Pour évaluer la synthèse des protéines musculaires et les taux de dégradation des protéines des jambes en réponse à l'alimentation, l'insuline sérique sera initialement maintenue à des concentrations à jeun par l'administration d'insuline (0,6 mU•m-2•min-1) pendant 120 minutes et, pour empêcher l'insuline endogène production, octréotide (30 ng•kg-1•min-1). Ensuite, pour simuler l'alimentation, les concentrations d'insuline sérique seront augmentées équivalentes à l'état nourri pendant 120 minutes (~40 mU•l-1) et 20 g d'acides aminés mixtes (Glamin® Fresenius-Kabi, Royaume-Uni) administrés par perfusion en association avec glucose pour stabiliser la glycémie (~4,5 mmol.l-1). Les infusions de versions d'isotopes stables de la phénylalanine et de la leucine seront maintenues tout au long de la visite expérimentale. Initialement, une seule dose d'amorçage de [2H5]phénylalanine (0,33 mg•kg-1 de masse corporelle, 98 atome % d'excès) et de [1-13C]leucine (0,8 mg•kg-1 de masse corporelle, 99 atome % d'excès) sera administré, suivi d'une perfusion constante de 0,5 mg•kg-1•h-1 de phénylalanine et de 1,0 mg•kg-1•h-1 de leucine. L'utilisation de ces deux isotopes stables en combinaison avec des biopsies musculaires obtenues à partir du muscle vaste latéral de la jambe à t = 0, 120 et 240 min et un prélèvement sanguin tout au long de la visite, permettra la synthèse des protéines musculaires et les taux de dégradation des protéines de la jambe en réponse à l'alimentation à calculer. À intervalles réguliers tout au long de la période expérimentale, les échanges de gaz respiratoires seront surveillés en mesurant l'absorption d'oxygène (O2) et la production de dioxyde de carbone (CO2) à l'aide d'un calorimètre indirect à hotte ventilée (NutrEn, Royaume-Uni) pour calculer le taux d'échange respiratoire.

Après la fin de la visite initiale où les mesures de base de la synthèse des protéines musculaires et de la dégradation des protéines des jambes en réponse à l'alimentation ont été établies, la période d'intervention médicamenteuse de 12 semaines commencera. À la fin de l'intervention de 12 semaines, la visite d'étude décrite ci-dessus sera répétée pour déterminer les effets de l'intervention sur les mesures de résultats énumérées.

Collecte d'échantillons:

Au début de chaque visite expérimentale, 8 ml de sang seront prélevés d'une canule veineuse dans des vacutainers d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Après centrifugation à 4°C, le plasma extrait sera stocké à -80°C pour permettre la détermination ultérieure des taux circulants de cytokines sélectionnées. Pendant le clamp à insuline, 1 ml de sang A-V sera prélevé toutes les 5 min pour le suivi de la concentration en glucose sanguin (YSI 2300 STATplus, Yellow Springs Instruments, USA). Le sang A-V (5 ml) sera prélevé au départ et à +30, +75, +90, +105, +120, +150, +195, +210, +225, +240 min, coagulé, centrifugé, et le sérum stocké dans l'azote liquide. L'insuline sera dosée dans ces échantillons à une date ultérieure avec un kit de dosage radio-immunologique (Coat-a-Count Insulin, USA). Des échantillons de sang veineux fémoral et A-V (2 ml) seront prélevés pour des mesures de traceur sanguin à -5, +75, +90, +105, +120, +195, +210, +225, +240 min, centrifugés à 4° C et stocké à -80°C. Des biopsies musculaires seront obtenues à partir du muscle vaste latéral à 0, +120 et +240 min en utilisant la technique de biopsie à l'aiguille percutanée. Les échantillons de muscle seront congelés instantanément dans de l'azote liquide avant la détermination de l'incorporation de [1-13C]leucine.

Suivi des sujets :

L'audit des études antérieures de l'investigateur impliquant des biopsies musculaires et des procédures de canulation a montré que les procédures étaient bien tolérées par les sujets et qu'elles entraînaient peu de complications importantes. La cicatrisation de la peau est minime et invisible après quelques mois. Toutes les biopsies musculaires sont réalisées dans des conditions stériles par du personnel médicalement qualifié et après injection d'anesthésique local. Tous les sujets sont soigneusement surveillés avant, pendant et après la procédure pour s'assurer qu'ils sont à l'aise à tout moment. Après chaque biopsie, la peau est fermée avec une bande adhésive stérile et recouverte d'un pansement adhésif étanche. Lors du retrait des canules, une pression est appliquée pour arrêter le saignement, et les sites habillés avec un pansement adhésif étanche. Avant de quitter le laboratoire, les sujets reçoivent un dépliant contenant des informations sur les soins ultérieurs et les coordonnées de nos cliniciens s'ils ont besoin de conseils. De plus, les sujets seront contactés par téléphone les semaines 2, 6 et 10 pour confirmer l'absence d'effets indésirables de l'administration du médicament. Les sujets recevront également des coordonnées qu'ils pourront utiliser en cas de problème.

Mesures et analyses :

Les échantillons de biopsie musculaire et les échantillons de sang doivent être mesurés pour l'incorporation du traceur, ce qui permet de calculer les taux de synthèse et de dégradation des protéines musculaires. Les échantillons de sang recueillis seront analysés pour déterminer les niveaux circulants de cytokines. En effectuant ces mesures avant et après le traitement par la pioglitazone, les conséquences de l'inflammation chez les personnes âgées sur le métabolisme musculaire seront déterminées. L'analyse statistique doit être effectuée à l'aide d'une analyse de la variance (ANOVA).