Effekt av fedme-avledede cytokiner på proteinomsetning og karbohydratmetabolisme i menneskelig skjelettmuskulatur

Rekruttering av fag:

24 overvektige (men ellers friske) deltakere med forhøyede cytokinnivåer og 24 ikke-overvektige personer med normale cytokinnivåer vil bli rekruttert. Etter det første eksperimentelle besøket (se nedenfor), vil deltakerne bli delt inn på en dobbeltblind måte i fire grupper (n=12). I tidligere studier som benytter lignende lavgradige inflammatoriske tilstander der tiazolidindioner har blitt administrert, har det blitt observert signifikante forskjeller (P<0,05) i prosesser under undersøkelse med gruppestørrelser på 10. Derfor er gruppestørrelser på 12 valgt for å imøtekomme det forventede frafallet på 15 % sett i langtidsstudier. Deltakerne vil være menn, alderstilpasset (>55 år), ikke-røykere, leve en stillesittende livsstil og ikke-vegetariske. Før de deltar i studien, vil alle forsøkspersoner gjennomgå medisinsk screening og fylle ut et generelt helsespørreskjema. Dette vil inkludere målinger av blodtrykk, hjertefrekvens, 12-avlednings elektrokardiogram (EKG), blodbiokjemi og en blodproppprofil. For ikke-kontrollpersoner vil inkludering i studien bli bestemt ved mål på midjeomkrets (>100 cm), og inflammatorisk status (ikke-overvektige personer med C-reaktive proteiner (CRP) plasmanivåer <1,35 μg.ml-1 og tumornekrosefaktor-alfa (TNFα) plasmanivåer <3,3 pg.ml-1 og overvektige personer med CRP >1,35 μg.ml-1 og TNFα >4,1 pg.ml-1). Etter en forklaring av studien og tilhørende prosedyrer, vil skriftlig samtykke innhentes og forsøkspersonene gjøres oppmerksomme på at de står fritt til å trekke seg når som helst. Emner vil bli rekruttert via presseannonser fra lokalbefolkningen.

Eksperimentelle forsøk:

Ved starten av en 12 uker lang studie, vil muskelproteinsyntese og nedbrytning av benprotein bli bestemt hos alle forsøkspersoner via administrering av stabile isotoper av leucin og fenylalanin samtidig med en to-trinns insulinklemme for å simulere å gå fra fastende til matet stat. Dette vil etablere basisverdiene for disse tiltakene før den 12 uker lange intervensjonsperioden. Disse tiltakene vil bli oppnådd i et enkelt besøk med utførelse av en etablert protokoll for bestemmelse av muskelproteinsyntese og benproteinnedbrytning. Oppsummert, for å oppnå dette vil følgende bli utført: en basal muskelbiopsi fra låret vil bli tatt, hvoretter seruminsulinkonsentrasjoner vil bli holdt på fastende nivåer og en ytterligere muskelbiopsi oppnådd; Når seruminsulinkonsentrasjonen er tatt vil konsentrasjonen økes og blandede aminosyrer administreres for å simulere fôring etterfulgt av en tredje og siste muskelbiopsi. Uttak av biopsier vil tillate bestemmelse av isotopinkorporering og dermed bestemmelse av muskelproteinsyntese og nedbrytningshastigheter for benprotein.

Etter det første eksperimentelle besøket vil forsøkspersonene starte en 12 ukers behandlingsperiode med enten pioglitazon (30 mg•dag-1) eller placebo, administrert på en dobbeltblind måte. Forsøkspersonene vil bli overvåket med intervaller gjennom hele perioden for å sikre samsvar og rapportere uønskede bivirkninger. Etter 12 uker med medikament- eller placeboadministrering, vil forsøkspersonene returnere til laboratoriet for en gjentakelse av målingene som ble bestemt i det første eksperimentelle besøket (muskelproteinsyntese og nedbrytning av benprotein som respons på simulert fôring). Sirkulerende nivåer av utvalgte cytokiner vil i tillegg bli undersøkt i blodprøver samlet inn fra forsøkspersoner ved starten av de to eksperimentelle besøkene (pre- og post-12-ukers legemiddelintervensjonsperiode), og dermed muliggjøre en vurdering av eventuelle assosierte endringer mellom systemiske cytokinkonsentrasjoner og muskelproteinsyntese og benproteinnedbrytning.

Studieprotokoll:

Studien involverer to besøk adskilt av en 12-ukers legemiddelintervensjonsperiode. Ved hvert av de to besøkene skal muskelproteinsyntese og nedbrytningshastigheter for benprotein som respons på simulert fôring vurderes ved å bruke en etablert eksperimentell protokoll beskrevet nedenfor:

Forsøkspersonene vil bli bedt om å avstå fra alkohol og trening i 48 timer før hvert forsøksbesøk og å ankomme morgenen for forsøksbesøket i fastende tilstand. Forsøkspersonene vil bli bedt om å hvile i en halvliggende stilling mens en kanyle settes inn retrograd inn i en overfladisk vene på den dorsale overflaten av den ikke-dominante hånden for blodprøvetaking. Hånden oppbevares i en håndvarmeenhet (lufttemperatur 50-55°C) for å arterialisere den venøse dreneringen av hånden. En kanyle vil bli plassert i en antecubital vene i hver underarm for infusjon av insulin, oktreotid, glukose, aminosyrer og stabilisotop-infusjoner av leucin og fenylalanin for å simulere fôring på nøyaktig måte; et kateter plassert i femoralvenen vil tillate, i forbindelse med arteriell-venøse (A-V) blodprøver, arteriell og venøs blodprøvetaking over benet. For å vurdere muskelproteinsyntese og nedbrytningshastigheter for benprotein som respons på fôring, vil seruminsulin initialt holdes ved fastende konsentrasjoner ved administrering av insulin (0,6 mU•m-2•min-1) i 120 minutter og for å forhindre endogent insulin. produksjon, oktreotid (30 ng•kg-1•min-1). Deretter, for å simulere fôring, vil seruminsulinkonsentrasjonen økes tilsvarende matet tilstand i 120 minutter (~40 mU•l-1) og 20 g blandede aminosyrer (Glamin® Fresenius-Kabi, Storbritannia) administrert ved infusjon i forbindelse med glukose for å stabilisere blodsukkerkonsentrasjonen (~4,5 mmol.l-1). Infusjoner av stabile isotopversjoner av fenylalanin og leucin vil opprettholdes gjennom hele forsøksbesøket. Til å begynne med vil en enkelt primingsdose av [2H5]fenylalanin (0,33 mg•kg-1 kroppsmasse, 98 atom % overskudd) og [1-13C]leucin (0,8 mg•kg-1 kroppsmasse, 99 atom % overskudd) være administrert, etterfulgt av en konstant infusjon av 0,5 mg•kg-1•h-1 fenylalanin og 1,0 mg•kg-1•h-1 leucin. Bruken av disse to stabile isotoper i kombinasjon med muskelbiopsier hentet fra vastus lateralis-muskelen i benet ved t = 0, 120 og 240 minutter og blodprøvetaking gjennom hele besøket, vil tillate muskelproteinsyntese og nedbrytningshastigheter for benprotein som respons til fôring skal beregnes. Med jevne mellomrom gjennom hele forsøksperioden vil respiratorisk gassutveksling bli overvåket ved å måle oksygen (O2) opptak og karbondioksid (CO2) produksjon ved hjelp av et ventilert hette indirekte kalorimeter (NutrEn, UK) for å beregne respirasjonsutvekslingsforholdet.

Etter fullføring av det første besøket hvor baselinemål for muskelproteinsyntese og nedbrytning av benprotein som respons på fôring er etablert, vil den 12 uker lange legemiddelintervensjonsperioden begynne. Etter fullføring av 12-ukers intervensjon, vil studiebesøket beskrevet ovenfor gjentas for å bestemme effekten av intervensjonen på de oppførte resultatmålene.

Prøvesamling:

Ved starten av hvert forsøksbesøk vil 8 ml blod samles opp fra en venekanyle i etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) vacutainere. Etter sentrifugering ved 4 °C vil det ekstraherte plasmaet lagres ved -80 °C for å muliggjøre senere bestemmelse av sirkulerende nivåer av utvalgte cytokiner. Under insulinklemmen vil det innhentes 1 ml A-V-blod hvert 5. minutt for overvåking av blodsukkerkonsentrasjonen (YSI 2300 STATplus, Yellow Springs Instruments, USA). A-V-blod (5 ml) vil bli samlet ved baseline og ved +30, +75, +90, +105, +120, +150, +195, +210, +225, +240 min, får koagulere, sentrifugert, og serumet lagret i flytende nitrogen. Insulin vil bli målt i disse prøvene på et senere tidspunkt med et radioimmunoassay-sett (Coat-a-Count Insulin, USA). Femoral venøs og A-V blodprøver (2 ml) vil bli tatt for blodspormålinger ved -5, +75, +90, +105, +120, +195, +210, +225, +240 min, sentrifugert ved 4° C og lagret ved -80°C. Muskelbiopsier vil bli tatt fra muskelen vastus lateralis ved 0, +120 og +240 min ved bruk av perkutan nålbiopsiteknikk. Muskelprøver vil bli hurtigfryst i flytende nitrogen før bestemmelse av [1-13C]leucininkorporering.

Etterbehandling av fagene:

Revisjon av etterforskerens tidligere studier som involverer muskelbiopsier og kanyleprosedyrer har vist at prosedyrene tolereres godt av forsøkspersoner og har få betydelige komplikasjoner. Arrdannelse i huden er minimal og usynlig etter noen måneder. Alle muskelbiopsier tas under sterile forhold av medisinsk kvalifisert personale og etter injeksjon av lokalbedøvelse. Alle forsøkspersoner overvåkes nøye før, under og etter prosedyren for å sikre at de er komfortable til enhver tid. Etter hver biopsi lukkes huden med en steril selvklebende stripe og dekkes med en vanntett klebende bandasje. Ved fjerning av kanylene påføres trykk for å stoppe blødningen, og stedene kles med en vanntett selvklebende bandasje. Forsøkspersonene får en brosjyre før de forlater laboratoriet som inneholder etterbehandlingsinformasjon og kontaktinformasjon til våre klinikere dersom de trenger råd. Videre vil forsøkspersonene bli kontaktet på telefon i uke 2, 6 og 10 for å bekrefte fraværet av eventuelle bivirkninger av medikamentadministrasjonen. Forsøkspersonene vil også få kontaktinformasjon som de kan bruke hvis de har noen bekymringer.

Målinger og analyser:

Muskelbiopsiprøver og blodprøver skal måles for inkorporering av sporstoffer, slik at hastigheten for muskelproteinsyntese og nedbrytning kan beregnes. Innsamlede blodprøver vil bli analysert for sirkulerende nivåer av cytokiner. Ved å utføre disse målingene før og etter pioglitazonbehandling, vil konsekvensene av betennelse hos eldre individer på muskelmetabolismen bli bestemt. Statistisk analyse skal utføres ved bruk av variansanalyse (ANOVA).