Effekt af fedme-afledte cytokiner på proteinomsætning og kulhydratmetabolisme i menneskelige skeletmuskler

Rekruttering af fag:

24 fede (men ellers sunde) deltagere med forhøjede cytokinniveauer og 24 ikke-overvægtige forsøgspersoner med normale cytokinniveauer vil blive rekrutteret. Efter det første eksperimentelle besøg (se nedenfor), vil deltagerne blive opdelt på en dobbeltblind måde i fire grupper (n=12). I tidligere undersøgelser med lignende lavgradige inflammatoriske tilstande, hvor thiazolidindioner er blevet administreret, er der observeret signifikante forskelle (P<0,05) i processer under undersøgelse med gruppestørrelser på 10. Derfor er gruppestørrelser på 12 blevet udvalgt til at imødekomme det forventede frafald på 15 % set i langtidsstudier. Deltagerne vil være mænd, aldersmatchede (>55 år), ikke-rygere, leve en stillesiddende livsstil og ikke-vegetariske. Før de deltager i undersøgelsen, vil alle forsøgspersoner gennemgå medicinsk screening og udfylde et generelt sundhedsspørgeskema. Dette vil omfatte målinger af blodtryk, hjertefrekvens, 12-aflednings elektrokardiogram (EKG), blodbiokemi og en blodkoagulationsprofil. For ikke-kontrolpersoner vil inklusion i undersøgelsen blive bestemt ved mål for taljeomkreds (>100 cm) og inflammatorisk status (ikke-overvægtige forsøgspersoner med C-reaktive proteiner (CRP) plasmaniveauer <1,35 μg.ml-1 og tumor necrosis factor-alpha (TNFα) plasmaniveauer <3,3 pg.ml-1 og overvægtige forsøgspersoner med en CRP >1,35 μg.ml-1 og TNFα >4,1 pg.ml-1). Efter en forklaring af undersøgelsen og tilknyttede procedurer vil der blive indhentet skriftligt samtykke, og forsøgspersoner gøres opmærksomme på, at de til enhver tid kan trække sig tilbage. Emner vil blive rekrutteret via presseannoncer fra lokalbefolkningen.

Eksperimentelle forsøg:

Ved starten af ​​et 12 uger langt studie vil muskelproteinsyntese og benproteinnedbrydning blive bestemt hos alle forsøgspersoner via administration af stabile isotoper af leucin og phenylalanin samtidig med en to-trins insulinklemme for at simulere at gå fra fastende til fødestat. Dette vil etablere basisværdierne for disse tiltag forud for den 12-ugers interventionsperiode. Disse foranstaltninger vil blive opnået i et enkelt besøg med udførelse af en etableret protokol til bestemmelse af muskelproteinsyntese og benproteinnedbrydning. Sammenfattende vil følgende blive udført for at opnå dette: en basal muskelbiopsi fra låret, hvorefter seruminsulinkoncentrationer vil blive holdt på fastende niveauer og en yderligere muskelbiopsi opnået; når det er taget, vil seruminsulinkoncentrationerne blive forhøjet, og blandede aminosyrer administreres for at simulere fodring efterfulgt af udtagning af en tredje og sidste muskelbiopsi. Udtagning af biopsier vil muliggøre bestemmelse af isotopinkorporering og derved bestemmelse af muskelproteinsyntese og benproteinnedbrydningshastigheder.

Efter det første forsøgsbesøg vil forsøgspersonerne påbegynde en 12 ugers behandlingsperiode med enten pioglitazon (30 mg•dag-1) eller placebo indgivet på en dobbeltblind måde. Forsøgspersoner vil blive overvåget med intervaller gennem hele perioden for at sikre overholdelse og rapportere uønskede bivirkninger. Efter 12 ugers lægemiddel- eller placeboadministration vil forsøgspersonerne vende tilbage til laboratoriet for en gentagelse af målingerne bestemt i det første forsøgsbesøg (muskelproteinsyntese og benproteinnedbrydning som reaktion på simuleret fodring). Cirkulerende niveauer af udvalgte cytokiner vil desuden blive undersøgt i blodprøver indsamlet fra forsøgspersoner ved starten af ​​de to eksperimentelle besøg (præ- og post-12-ugers lægemiddelinterventionsperiode), hvilket muliggør en vurdering af eventuelle associerede ændringer mellem systemiske cytokinkoncentrationer og muskelproteinsyntese og benproteinnedbrydning.

Undersøgelsesprotokol:

Undersøgelsen involverer to besøg adskilt af en 12-ugers lægemiddelinterventionsperiode. Ved hvert af de to besøg skal muskelproteinsyntese og benproteinnedbrydningshastigheder som reaktion på simuleret fodring vurderes ved hjælp af en etableret eksperimentel protokol beskrevet nedenfor:

Forsøgspersonerne vil blive bedt om at afholde sig fra alkohol og motion i 48 timer før hvert forsøgsbesøg og ankomme om morgenen for forsøgsbesøget i fastende tilstand. Forsøgspersoner vil blive bedt om at hvile i en semi-liggende stilling, mens en kanyle indsættes retrograd i en overfladisk vene på den dorsale overflade af den ikke-dominante hånd til blodprøvetagning. Hånden opbevares i en håndopvarmningsenhed (lufttemperatur 50-55°C) for at arterialisere den venøse dræning af hånden. En kanyle vil blive placeret i en antecubital vene i hver underarm til infusion af insulin, octreotid, glucose, aminosyrer og stabil-isotop-infusioner af leucin og phenylalanin for at simulere fodring på præcis måde; et kateter placeret i lårbensvenen vil i forbindelse med arterialiserede-venøse (A-V) blodprøver muliggøre arteriel og venøs blodprøver på tværs af benet. For at vurdere muskelproteinsyntese og benproteinnedbrydningshastigheder som reaktion på fodring, vil seruminsulin initialt blive holdt ved fastende koncentrationer ved administration af insulin (0,6 mU•m-2•min-1) i 120 minutter og for at forhindre endogen insulin produktion, Octreotid (30 ng•kg-1•min-1). For at simulere fodring vil seruminsulinkoncentrationerne derefter blive øget svarende til den fodrede tilstand i 120 minutter (~40 mU•l-1) og 20 g blandede aminosyrer (Glamin® Fresenius-Kabi, UK) administreret ved infusion i forbindelse med glukose for at stabilisere blodsukkerkoncentrationer (~4,5 mmol.l-1). Infusioner af stabile isotopversioner af phenylalanin og leucin vil blive opretholdt under hele forsøgsbesøget. Indledningsvis vil en enkelt primingdosis af [2H5]phenylalanin (0,33 mg•kg-1 kropsmasse, 98 atom % overskud) og [1-13C]leucin (0,8 mg•kg-1 kropsmasse, 99 atom % overskud) være indgivet, efterfulgt af en konstant infusion af 0,5 mg•kg-1•h-1 phenylalanin og 1,0 mg•kg-1•h-1 leucin. Brugen af ​​disse to stabile isotoper i kombination med muskelbiopsier opnået fra benets vastus lateralis muskel ved t = 0, 120 og 240 minutter og blodprøvetagning under hele besøget, vil tillade muskelproteinsyntese og benproteinnedbrydningshastigheder som svar til fodring skal beregnes. Med jævne mellemrum gennem hele forsøgsperioden vil respiratorisk gasudveksling blive overvåget ved at måle ilt (O2) optagelse og kuldioxid (CO2) produktion ved hjælp af et ventileret emhætte indirekte kalorimeter (NutrEn, UK) til at beregne respiratorisk udvekslingsforhold.

Efter afslutningen af ​​det indledende besøg, hvor baseline målinger af muskelproteinsyntese og benproteinnedbrydning som reaktion på fodring er blevet etableret, begynder den 12-ugers lægemiddelinterventionsperiode. Efter afslutningen af ​​den 12-ugers intervention vil det ovenfor beskrevne studiebesøg blive gentaget for at bestemme virkningerne af interventionen på de anførte resultatmål.

Prøvesamling:

Ved starten af ​​hvert forsøgsbesøg vil 8 ml blod blive opsamlet fra en venekanyle i ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) vacutainere. Efter centrifugering ved 4°C vil det ekstraherede plasma blive opbevaret ved -80°C for at muliggøre senere bestemmelse af cirkulerende niveauer af udvalgte cytokiner. Under insulinklemmen udtages 1 ml A-V blod hvert 5. minut til overvågning af blodsukkerkoncentrationen (YSI 2300 STATplus, Yellow Springs Instruments, USA). A-V-blod (5 ml) vil blive opsamlet ved baseline og ved +30, +75, +90, +105, +120, +150, +195, +210, +225, +240 min, får lov til at størkne, centrifugeres, og serummet opbevaret i flydende nitrogen. Insulin vil blive målt i disse prøver på et senere tidspunkt med et radioimmunoassay-kit (Coat-a-Count Insulin, USA). Femorale vene- og A-V-blodprøver (2 ml) vil blive taget til blodspormålinger ved -5, +75, +90, +105, +120, +195, +210, +225, +240 min, centrifugeret ved 4° C og opbevaret ved -80°C. Muskelbiopsier vil blive opnået fra vastus lateralis-musklen ved 0, +120 og +240 minutter ved brug af perkutan nålebiopsiteknik. Muskelprøver vil blive lynfrosset i flydende nitrogen før bestemmelse af [1-13C]leucininkorporering.

Efterbehandling af fagene:

Revision af efterforskerens tidligere undersøgelser, der involverede muskelbiopsier og kanyleringsprocedurer, har vist, at procedurerne tolereres godt af forsøgspersoner og har få væsentlige komplikationer. Ardannelse i huden er minimal og usynlig efter et par måneder. Alle muskelbiopsier udtages under sterile forhold af medicinsk kvalificeret personale og efter indsprøjtning af lokalbedøvelse. Alle forsøgspersoner overvåges omhyggeligt før, under og efter proceduren for at sikre, at de hele tiden er komfortable. Efter hver biopsi lukkes huden med en steril klæbestrimmel og dækkes med en vandtæt klæbende forbinding. Ved fjernelse af kanylerne påføres tryk for at stoppe blødning, og stederne klædes med en vandtæt klæbende forbinding. Forsøgspersonerne får udleveret en folder, før de forlader laboratoriet, med information om efterbehandling og kontaktoplysninger på vores klinikere, hvis de har brug for rådgivning. Yderligere vil forsøgspersoner blive kontaktet telefonisk i uge 2, 6 og 10 for at bekræfte fraværet af eventuelle bivirkninger af lægemiddeladministrationen. Emner vil også blive forsynet med kontaktoplysninger, som de kan bruge, hvis de har nogen bekymringer.

Målinger og analyser:

Muskelbiopsiprøver og blodprøver skal måles for inkorporering af sporstoffer, hvilket gør det muligt at beregne hastigheder for muskelproteinsyntese og nedbrydning. Indsamlede blodprøver vil blive analyseret for cirkulerende niveauer af cytokiner. Ved at udføre disse målinger før og efter pioglitazonbehandling vil konsekvenserne af betændelse hos ældre individer på muskelmetabolismen blive bestemt. Statistisk analyse skal udføres ved brug af variansanalyse (ANOVA).