Effekt av fetma härledda cytokiner på proteinomsättning och kolhydratmetabolism i mänsklig skelettmuskel

Rekrytering av ämnen:

24 överviktiga (men i övrigt friska) deltagare med förhöjda cytokinnivåer och 24 icke-överviktiga försökspersoner med normala cytokinnivåer kommer att rekryteras. Efter det första experimentbesöket (se nedan) kommer deltagarna att delas in på ett dubbelblindt sätt i fyra grupper (n=12). I tidigare studier med liknande låggradiga inflammatoriska tillstånd där tiazolidindioner har administrerats, har signifikanta skillnader (P<0,05) i undersökta processer observerats med gruppstorlekar på 10. Därför har gruppstorlekar på 12 valts ut för att tillgodose det förväntade bortfallet på 15 % i långtidsstudier. Deltagarna kommer att vara män, åldersmatchade (>55 år), rökfria, leva en stillasittande livsstil och icke-vegetariska. Innan de deltar i studien kommer alla försökspersoner att genomgå medicinsk screening och fylla i ett allmänt hälsofrågeformulär. Detta kommer att innefatta mätningar av blodtryck, hjärtfrekvens, 12-avledningselektrokardiogram (EKG), blodbiokemi och en blodproppsprofil. För icke-kontrollpersoner kommer inkludering i studien att bestämmas genom mått på midjemått (>100 cm) och inflammatorisk status (icke-överviktiga patienter med C-reaktiva proteiner (CRP) plasmanivåer <1,35 μg.ml-1 och tumörnekrosfaktor-alfa (TNFα) plasmanivåer <3,3 pg.ml-1 och överviktiga patienter med CRP >1,35 μg.ml-1 och TNFα >4,1 pg.ml-1). Efter en förklaring av studien och tillhörande procedurer kommer skriftligt medgivande att erhållas och försökspersonerna göras medvetna om att de är fria att dra sig tillbaka när som helst. Ämnen kommer att rekryteras via pressannonser från lokalbefolkningen.

Experimentella försök:

I början av en 12 veckor lång studie kommer muskelproteinsyntes och benproteinnedbrytning att bestämmas hos alla försökspersoner via administrering av stabila isotoper av leucin och fenylalanin samtidigt med en tvåstegs insulinklämma för att simulera att gå från fastande till matad stat. Detta kommer att fastställa baslinjevärdena för dessa åtgärder före den 12 veckor långa interventionsperioden. Dessa åtgärder kommer att uppnås i ett enda besök med genomförandet av ett etablerat protokoll för bestämning av muskelproteinsyntes och benproteinnedbrytning. Sammanfattningsvis, för att uppnå detta kommer följande att utföras: en basal muskelbiopsi från låret kommer att erhållas varefter seruminsulinkoncentrationer kommer att hållas vid fastande nivåer och en ytterligare muskelbiopsi erhålls; en gång intaget kommer insulinkoncentrationerna i serum att höjas och blandade aminosyror administreras för att simulera matning följt av en tredje och sista muskelbiopsi. Ta biopsier kommer att möjliggöra bestämning av isotopinkorporering och därigenom bestämning av muskelproteinsyntes och benproteinnedbrytningshastigheter.

Efter det första experimentbesöket kommer försökspersonerna att påbörja en 12 veckors behandlingsperiod med antingen pioglitazon (30 mg•dag-1) eller placebo, administrerat på ett dubbelblindt sätt. Försökspersoner kommer att övervakas med intervaller under hela perioden för att säkerställa efterlevnad och rapportera oönskade biverkningar. Efter 12 veckors administrering av läkemedel eller placebo kommer försökspersonerna att återvända till laboratoriet för en upprepning av mätningarna som bestämdes vid det första experimentella besöket (muskelproteinsyntes och benproteinnedbrytning som svar på simulerad matning). Cirkulerande nivåer av utvalda cytokiner kommer dessutom att undersökas i blodprover som samlas in från försökspersoner i början av de två experimentella besöken (för och efter 12 veckors läkemedelsinterventionsperiod), vilket möjliggör en bedömning av eventuella associerade förändringar mellan systemiska cytokinkoncentrationer och muskelproteinsyntes och benproteinnedbrytning.

Studieprotokoll:

Studien omfattar två besök åtskilda av en 12-veckors läkemedelsinterventionsperiod. Vid vart och ett av de två besöken ska muskelproteinsyntes och benproteinnedbrytningshastigheter som svar på simulerad utfodring bedömas med hjälp av ett etablerat experimentellt protokoll som beskrivs nedan:

Försökspersonerna kommer att uppmanas att avstå från alkohol och träna i 48 timmar före varje experimentbesök och att anlända på morgonen för experimentbesöket i fastande tillstånd. Försökspersonerna kommer att bli ombedda att vila i en halvliggande ställning medan en kanyl förs in retrograd i en ytlig ven på den dorsala ytan av den icke-dominanta handen för blodprovstagning. Handen förvaras i en handvärmningsenhet (lufttemperatur 50-55°C) för att arterialisera handens venösa dränering. En kanyl kommer att placeras i en antecubital ven i varje underarm för infusion av insulin, oktreotid, glukos, aminosyror och stabilisotopinfusioner av leucin och fenylalanin för att simulera matning på ett exakt sätt; en kateter placerad i lårbensvenen kommer, tillsammans med arteriellt venösa (A-V) blodprov, att ta arteriell och venös blodprov över benet. För att bedöma muskelproteinsyntesen och benproteinnedbrytningshastigheten som svar på utfodring, kommer seruminsulin initialt att hållas vid fastande koncentrationer genom administrering av insulin (0,6 mU•m-2•min-1) i 120 minuter och för att förhindra endogent insulin. produktion, oktreotid (30 ng•kg-1•min-1). Sedan, för att simulera utfodring, kommer seruminsulinkoncentrationerna att ökas ekvivalent med matningstillståndet under 120 minuter (~40 mU•l-1) och 20 g blandade aminosyror (Glamin® Fresenius-Kabi, Storbritannien) administrerade som infusion i samband med glukos för att stabilisera blodglukoskoncentrationerna (~4,5 mmol.l-1). Infusioner av stabila isotopversioner av fenylalanin och leucin kommer att upprätthållas under hela experimentbesöket. Initialt kommer en engångsdos av [2H5]fenylalanin (0,33 mg•kg-1 kroppsmassa, 98 atom% överskott) och [1-13C]leucin (0,8 mg•kg-1 kroppsmassa, 99 atom% överskott) att vara administreras, följt av en konstant infusion av 0,5 mg•kg-1•h-1 fenylalanin och 1,0 mg•kg-1•h-1 leucin. Användningen av dessa två stabila isotoper i kombination med muskelbiopsier erhållna från benets vastus lateralis muskel vid t = 0, 120 och 240 minuter och blodprovstagning under hela besöket, kommer att tillåta muskelproteinsyntes och benproteinnedbrytningshastigheter som svar till utfodring som ska beräknas. Med jämna mellanrum under hela försöksperioden kommer andningsgasutbytet att övervakas genom att mäta syreupptag (O2) och koldioxid (CO2) produktion med hjälp av en ventilerad huva indirekt kalorimeter (NutrEn, Storbritannien) för att beräkna andningsutbytesförhållandet.

Efter avslutat inledande besök där baslinjemått för muskelproteinsyntes och benproteinnedbrytning som svar på utfodring har fastställts, kommer den 12 veckor långa läkemedelsinterventionsperioden att börja. Efter avslutad 12-veckors intervention kommer studiebesöket som beskrivs ovan att upprepas för att fastställa effekterna av interventionen på de listade resultatmåtten.

Provsamling:

I början av varje experimentbesök kommer 8 ml blod att samlas upp från en venkanyl i etylendiamintetraättiksyra (EDTA) vacutainers. Efter centrifugering vid 4°C kommer den extraherade plasman att förvaras vid -80°C för att möjliggöra senare bestämning av cirkulerande nivåer av utvalda cytokiner. Under insulinklämman kommer 1 ml A-V-blod att tas var 5:e minut för övervakning av blodsockerkoncentrationen (YSI 2300 STATplus, Yellow Springs Instruments, USA). A-V-blod (5 ml) kommer att samlas in vid baslinjen och vid +30, +75, +90, +105, +120, +150, +195, +210, +225, +240 min, tillåts koagulera, centrifugeras, och serumet lagrat i flytande kväve. Insulin kommer att mätas i dessa prover vid ett senare tillfälle med ett radioimmunoassay-kit (Coat-a-Count Insulin, USA). Femorala venösa och A-V blodprover (2 ml) kommer att tas för blodspårmätningar vid -5, +75, +90, +105, +120, +195, +210, +225, +240 min, centrifugeras vid 4° C och förvaras vid -80°C. Muskelbiopsier kommer att erhållas från vastus lateralis-muskeln vid 0, +120 och +240 minuter med hjälp av perkutana nålbiopsiteknik. Muskelprover kommer att snabbfrysas i flytande kväve innan bestämningen av [1-13C]leucininkorporering.

Eftervård av ämnen:

Granskning av utredarens tidigare studier som involverade muskelbiopsier och kanyleringsprocedurer har visat att procedurerna tolereras väl av försökspersoner och har få betydande komplikationer. Ärrbildning i huden är minimal och osynlig efter några månader. Alla muskelbiopsier tas under sterila förhållanden av medicinskt kvalificerad personal och efter injektion av lokalbedövning. Alla försökspersoner övervakas noggrant före, under och efter proceduren för att säkerställa att de alltid är bekväma. Efter varje biopsi stängs huden med en steril självhäftande remsa och täcks med ett vattentätt självhäftande förband. Vid avlägsnande av kanylerna appliceras tryck för att stoppa blödningen och ställena kläds med ett vattentätt självhäftande förband. Försökspersonerna får en broschyr innan de lämnar laboratoriet med information om eftervård och kontaktuppgifter till våra läkare om de behöver råd. Vidare kommer försökspersoner att kontaktas per telefon under veckorna 2, 6 och 10 för att bekräfta frånvaron av några negativa effekter av läkemedelsadministrationen. Ämnen kommer också att få kontaktuppgifter som de kan använda om de har några problem.

Mätningar och analys:

Muskelbiopsiprover och blodprover ska mätas för inkorporering av spårämnen, så att hastigheten för muskelproteinsyntes och nedbrytning kan beräknas. Insamlade blodprover kommer att analyseras för cirkulerande nivåer av cytokiner. Genom att utföra dessa mätningar före och efter pioglitazonbehandling kommer konsekvenserna av inflammation hos äldre individer på muskelmetabolismen att fastställas. Statistisk analys ska utföras med variansanalys (ANOVA).