Efeito das citocinas derivadas da obesidade na renovação de proteínas e no metabolismo de carboidratos no músculo esquelético humano

Recrutamento de sujeitos:

Serão recrutados 24 participantes obesos (mas saudáveis) com níveis elevados de citocinas e 24 indivíduos não obesos com níveis normais de citocinas. Após a primeira visita experimental (ver abaixo), os participantes serão divididos de forma duplo-cega em quatro grupos (n = 12). Em estudos anteriores utilizando estados inflamatórios de baixo grau semelhantes em que tiazolidinedionas foram administradas, diferenças significativas (P <0,05) em processos sob investigação foram observadas com tamanhos de grupo de 10. Portanto, tamanhos de grupo de 12 foram selecionados para acomodar o abandono antecipado de 15% observado em estudos de longo prazo. Os participantes serão do sexo masculino, da mesma idade (> 55 anos), não fumantes, com estilo de vida sedentário e não vegetarianos. Antes de participar do estudo, todos os indivíduos passarão por triagem médica e preencherão um questionário de saúde geral. Isso incluirá medidas de pressão arterial, frequência cardíaca, eletrocardiograma de 12 derivações (ECG), bioquímica sanguínea e um perfil de coagulação sanguínea. Para indivíduos não-controle, a inclusão no estudo será determinada por medidas de circunferência da cintura (>100 cm) e estado inflamatório (sujeitos não obesos com níveis plasmáticos de proteína C-reativa (PCR) <1,35 μg.ml-1 e níveis plasmáticos de fator de necrose tumoral alfa (TNFα) <3,3 pg.ml-1 e indivíduos obesos com PCR >1,35 μg.ml-1 e TNFα >4,1 pg.ml-1). Após uma explicação do estudo e dos procedimentos associados, será obtido o consentimento por escrito e os participantes informados de que são livres para desistir a qualquer momento. Os participantes serão recrutados por meio de anúncios na imprensa da população local.

Testes experimentais:

No início de um estudo de 12 semanas, a síntese de proteína muscular e a quebra de proteína da perna serão determinadas em todos os indivíduos por meio da administração de isótopos estáveis ​​de leucina e fenilalanina concomitante a um clamp de insulina de dois estágios para simular a passagem de jejum para Estado alimentado. Isso estabelecerá os valores de linha de base para essas medidas antes do período de intervenção de 12 semanas. Essas medidas serão obtidas em uma única visita com a execução de um protocolo estabelecido para a determinação da síntese de proteína muscular e quebra de proteína da perna. Em resumo, para conseguir isso, será realizado o seguinte: uma biópsia muscular basal da coxa será obtida, após a qual as concentrações séricas de insulina serão mantidas em níveis de jejum e uma nova biópsia muscular será obtida; uma vez coletadas, as concentrações séricas de insulina serão elevadas e os aminoácidos misturados serão administrados para simular a alimentação, seguida pela coleta de uma terceira e última biópsia muscular. A obtenção de biópsias permitirá a determinação da incorporação de isótopos e, assim, a determinação da síntese de proteínas musculares e das taxas de degradação de proteínas da perna.

Após a primeira visita experimental, os indivíduos iniciarão um período de tratamento de 12 semanas com pioglitazona (30 mg•dia-1) ou um placebo, administrado de forma duplo-cega. Os indivíduos serão monitorados em intervalos ao longo do período para garantir a conformidade e relatar efeitos colaterais indesejados. Após 12 semanas de administração do fármaco ou placebo, os sujeitos retornarão ao laboratório para repetir as medidas determinadas na primeira visita experimental (síntese de proteína muscular e quebra de proteína da perna em resposta à alimentação simulada). Os níveis circulantes de citocinas selecionadas serão adicionalmente examinados em amostras de sangue coletadas de indivíduos no início das duas visitas experimentais (período de intervenção medicamentosa de 12 semanas antes e depois), permitindo assim uma avaliação de quaisquer alterações associadas entre as concentrações sistêmicas de citocinas e Síntese de proteínas musculares e quebra de proteínas nas pernas.

Protocolo de estudo:

O estudo envolve duas visitas separadas por um período de intervenção medicamentosa de 12 semanas. Em cada uma das duas visitas, a síntese de proteína muscular e as taxas de quebra de proteína da perna em resposta à alimentação simulada devem ser avaliadas usando um protocolo experimental estabelecido descrito abaixo:

Os indivíduos serão solicitados a abster-se de álcool e exercícios por 48 horas antes de cada visita experimental e chegar na manhã da visita experimental em estado de jejum. Os indivíduos serão solicitados a descansar em posição semi-supina enquanto uma cânula é inserida retrógrada em uma veia superficial na superfície dorsal da mão não dominante para coleta de sangue. A mão será mantida em uma unidade de aquecimento de mãos (temperatura do ar 50-55°C) para arterializar a drenagem venosa da mão. Uma cânula será colocada em uma veia antecubital em cada antebraço para a infusão de insulina, octreotide, glicose, aminoácidos e infusões de isótopos estáveis ​​de leucina e fenilalanina para simular a alimentação de maneira precisa; um cateter colocado na veia femoral permitirá, em conjunto com amostras de sangue venoso arterial (A-V), amostras de sangue arterial e venoso em toda a perna. Para avaliar a síntese de proteína muscular e as taxas de quebra de proteína da perna em resposta à alimentação, a insulina sérica será inicialmente mantida em concentrações de jejum pela administração de insulina (0,6 mU•m-2•min-1) por 120 minutos e, para prevenir a insulina endógena produção, Octreotide (30 ng•kg-1•min-1). Então, para simular a alimentação, as concentrações séricas de insulina serão aumentadas equivalentes ao estado alimentado por 120 minutos (~40 mU•l-1) e 20g de aminoácidos mistos (Glamin® Fresenius-Kabi, Reino Unido) administrados por infusão em conjunto com glicose para estabilizar as concentrações de glicose no sangue (~4,5 mmol.l-1). Infusões de versões isotópicas estáveis ​​de fenilalanina e leucina serão mantidas durante toda a visita experimental. Inicialmente, uma única dose inicial de [2H5]fenilalanina (0,33 mg•kg-1 massa corporal, 98 átomos % de excesso) e [1-13C]leucina (0,8 mg•kg-1 massa corporal, 99 átomos % de excesso) será administrado, seguido de infusão constante de 0,5 mg•kg-1•h-1 de fenilalanina e 1,0 mg•kg-1•h-1 de leucina. O uso desses dois isótopos estáveis ​​em combinação com biópsias musculares obtidas do músculo vasto lateral da perna em t = 0, 120 e 240 min e amostragem de sangue durante a visita, permitirá a síntese de proteínas musculares e taxas de degradação de proteínas da perna em resposta à alimentação a ser calculada. Em intervalos regulares ao longo do período experimental, as trocas gasosas respiratórias serão monitoradas medindo a captação de oxigênio (O2) e a produção de dióxido de carbono (CO2) usando um calorímetro indireto ventilado (NutrEn, Reino Unido) para calcular a taxa de troca respiratória.

Após a conclusão da visita inicial, onde foram estabelecidas medidas basais de síntese de proteína muscular e quebra de proteína da perna em resposta à alimentação, o período de intervenção medicamentosa de 12 semanas começará. Após a conclusão da intervenção de 12 semanas, a visita do estudo descrita acima será repetida para determinar os efeitos da intervenção nas medidas de resultado listadas.

Coleta de amostras:

No início de cada visita experimental, 8 ml de sangue serão coletados de uma cânula venosa para vacutainers de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Após centrifugação a 4°C, o plasma extraído será armazenado a -80°C para permitir a posterior determinação dos níveis circulantes de citocinas selecionadas. Durante o clamp de insulina, 1 ml de sangue A-V será obtido a cada 5 min para o monitoramento da concentração de glicose no sangue (YSI 2300 STATplus, Yellow Springs Instruments, EUA). Sangue A-V (5 ml) será coletado no início e em +30, +75, +90, +105, +120, +150, +195, +210, +225, +240 min, deixado coagular, centrifugado, e o soro armazenado em nitrogênio líquido. A insulina será medida nessas amostras posteriormente com um kit de radioimunoensaio (Coat-a-Count Insulin, EUA). Amostras de sangue venoso femoral e A-V (2 ml) serão coletadas para medições de traçadores de sangue a -5, +75, +90, +105, +120, +195, +210, +225, +240 min, centrifugadas a 4° C e armazenado a -80°C. Serão obtidas biópsias musculares do músculo vasto lateral nos tempos 0, +120 e +240 min pela técnica de biopsia percutânea por agulha. Amostras de músculo serão congeladas em nitrogênio líquido antes da determinação da incorporação de [1-13C]leucina.

Cuidados posteriores com os sujeitos:

A auditoria dos estudos anteriores do investigador envolvendo biópsias musculares e procedimentos de canulação mostrou que os procedimentos são bem tolerados pelos indivíduos e apresentam poucas complicações significativas. A cicatrização da pele é mínima e invisível após alguns meses. Todas as biópsias musculares são obtidas em condições estéreis por pessoal médico qualificado e após a injeção de anestésico local. Todos os indivíduos são cuidadosamente monitorados antes, durante e após o procedimento para garantir que estejam confortáveis ​​o tempo todo. Após cada biópsia, a pele é fechada com uma fita adesiva estéril e coberta com um curativo adesivo à prova d'água. Na remoção das cânulas, aplica-se pressão para estancar o sangramento e os locais são cobertos com um curativo adesivo à prova d'água. Os indivíduos recebem um folheto antes de deixarem o laboratório contendo informações sobre cuidados posteriores e detalhes de contato de nossos médicos, caso precisem de orientação. Além disso, os indivíduos serão contatados por telefone nas semanas 2, 6 e 10 para confirmar a ausência de quaisquer efeitos adversos da administração do medicamento. Os participantes também receberão detalhes de contato que podem usar caso tenham alguma dúvida.

Medições e análises:

Amostras de biópsia muscular e amostras de sangue devem ser medidas para incorporação de traçadores, permitindo que as taxas de síntese e degradação de proteínas musculares sejam calculadas. Amostras de sangue coletadas serão analisadas quanto aos níveis circulantes de citocinas. Ao realizar essas medições antes e depois do tratamento com pioglitazona, serão determinadas as consequências da inflamação em indivíduos idosos sobre o metabolismo muscular. A análise estatística deve ser realizada usando a análise de variância (ANOVA).