Efecto de las citoquinas derivadas de la obesidad sobre el recambio de proteínas y el metabolismo de los carbohidratos en el músculo esquelético humano

Reclutamiento de sujetos:

Se reclutarán 24 participantes obesos (pero por lo demás sanos) con niveles elevados de citoquinas y 24 sujetos no obesos con niveles normales de citoquinas. Después de la primera visita experimental (ver más abajo), los participantes se dividirán de forma doble ciego en cuatro grupos (n=12). En estudios previos que utilizaron estados inflamatorios de bajo grado similares donde se administraron tiazolidinedionas, se observaron diferencias significativas (P<0.05) en los procesos bajo investigación con tamaños de grupo de 10. Por lo tanto, se seleccionaron tamaños de grupo de 12 para adaptarse al abandono previsto del 15 % que se observa en los estudios a largo plazo. Los participantes serán hombres, de la misma edad (>55 años), no fumadores, con un estilo de vida sedentario y no vegetarianos. Antes de participar en el estudio, todos los sujetos se someterán a un examen médico y completarán un cuestionario de salud general. Esto incluirá medidas de presión arterial, frecuencia cardíaca, electrocardiograma (ECG) de 12 derivaciones, bioquímica sanguínea y un perfil de coagulación sanguínea. Para los sujetos no control, la inclusión en el estudio estará determinada por las medidas de la circunferencia de la cintura (> 100 cm) y el estado inflamatorio (sujetos no obesos con niveles plasmáticos de proteínas C reactivas (PCR) <1,35 μg.ml-1 y niveles plasmáticos del factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) <3,3 pg.ml-1 y sujetos obesos con PCR >1,35 μg.ml-1 y TNFα >4,1 pg.ml-1). Tras una explicación del estudio y los procedimientos asociados, se obtendrá el consentimiento por escrito y se informará a los sujetos de que son libres de retirarse en cualquier momento. Los sujetos serán reclutados a través de anuncios de prensa de la población local.

Ensayos experimentales:

Al comienzo de un estudio de 12 semanas de duración, se determinará la síntesis de proteínas musculares y la descomposición de las proteínas de las piernas en todos los sujetos mediante la administración de isótopos estables de leucina y fenilalanina junto con una pinza de insulina en dos etapas para simular el paso del estado en ayunas al estado alimentado. Esto establecerá los valores de referencia para estas medidas antes del período de intervención de 12 semanas. Estas medidas se conseguirán en una única visita con la ejecución de un protocolo establecido para la determinación de la síntesis proteica muscular y la degradación proteica de piernas. En resumen, para lograr esto se realizará lo siguiente: se obtendrá una biopsia del músculo basal del muslo, después de lo cual se mantendrán las concentraciones de insulina sérica en los niveles de ayuno y se obtendrá una biopsia muscular adicional; una vez tomadas, se elevarán las concentraciones de insulina sérica y se administrarán aminoácidos mixtos para simular la alimentación, seguido de la toma de una tercera y última biopsia muscular. La toma de biopsias permitirá la determinación de la incorporación de isótopos y, por lo tanto, la determinación de la síntesis de proteínas musculares y las tasas de degradación de proteínas de las piernas.

Después de la primera visita experimental, los sujetos comenzarán un período de tratamiento de 12 semanas con pioglitazona (30 mg•día-1) o un placebo, administrado de forma doble ciego. Los sujetos serán monitoreados a intervalos a lo largo del período para asegurar el cumplimiento y reportar efectos secundarios no deseados. Después de 12 semanas de administración del fármaco o del placebo, los sujetos volverán al laboratorio para repetir las mediciones determinadas en la primera visita experimental (síntesis de proteínas musculares y descomposición de proteínas de las piernas en respuesta a la alimentación simulada). Los niveles circulantes de citocinas seleccionadas se examinarán adicionalmente en muestras de sangre recolectadas de sujetos al comienzo de las dos visitas experimentales (antes y después del período de intervención del fármaco de 12 semanas), lo que permitirá evaluar cualquier cambio asociado entre las concentraciones de citocinas sistémicas y Síntesis de proteínas musculares y descomposición de proteínas de las piernas.

Protocolo de estudio:

El estudio incluye dos visitas separadas por un período de intervención de drogas de 12 semanas. En cada una de las dos visitas, se evaluarán las tasas de síntesis de proteínas musculares y de degradación de proteínas de las piernas en respuesta a la alimentación simulada utilizando un protocolo experimental establecido que se describe a continuación:

Se pedirá a los sujetos que se abstengan de consumir alcohol y hacer ejercicio durante 48 horas antes de cada visita experimental y que lleguen en ayunas la mañana de la visita experimental. Se les pedirá a los sujetos que descansen en una posición semisupina mientras se inserta una cánula retrógrada en una vena superficial en la superficie dorsal de la mano no dominante para tomar muestras de sangre. La mano se mantendrá en una unidad de calentamiento de manos (temperatura del aire 50-55°C) para arterializar el drenaje venoso de la mano. Se colocará una cánula en una vena antecubital de cada antebrazo para la infusión de insulina, octreótido, glucosa, aminoácidos e infusiones de isótopos estables de leucina y fenilalanina para simular la alimentación de manera precisa; un catéter colocado en la vena femoral permitirá, junto con muestras de sangre arterial-venosa (A-V), tomar muestras de sangre arterial y venosa a lo largo de la pierna. Para evaluar la síntesis de proteínas musculares y las tasas de descomposición de las proteínas de las piernas en respuesta a la alimentación, la insulina sérica se mantendrá inicialmente en concentraciones de ayuno mediante la administración de insulina (0,6 mU•m-2•min-1) durante 120 minutos y, para evitar la insulina endógena. producción, Octreotide (30 ng•kg-1•min-1). Luego, para simular la alimentación, se aumentarán las concentraciones de insulina sérica equivalentes al estado de alimentación durante 120 minutos (~40 mU•l-1) y 20 g de aminoácidos mixtos (Glamin® Fresenius-Kabi, Reino Unido) administrados por infusión junto con glucosa para estabilizar las concentraciones de glucosa en sangre (~4,5 mmol.l-1). Las infusiones de versiones de isótopos estables de fenilalanina y leucina se mantendrán durante toda la visita experimental. Inicialmente, se administrará una dosis de cebado única de [2H5]fenilalanina (0,33 mg•kg-1 de masa corporal, 98 % de exceso de átomos) y [1-13C]leucina (0,8 mg•kg-1 de masa corporal, 99 % de exceso de átomos). administrado, seguido de una infusión constante de 0,5 mg•kg-1•h-1 de fenilalanina y 1,0 mg•kg-1•h-1 de leucina. El uso de estos dos isótopos estables en combinación con biopsias musculares obtenidas del músculo vasto lateral de la pierna en t = 0, 120 y 240 min y muestras de sangre durante la visita, permitirán la síntesis de proteínas musculares y las tasas de degradación de proteínas de las piernas en respuesta. a la alimentación a calcular. A intervalos regulares a lo largo del período experimental, se controlará el intercambio de gases respiratorios midiendo el consumo de oxígeno (O2) y la producción de dióxido de carbono (CO2) utilizando un calorímetro indirecto de campana ventilada (NutrEn, Reino Unido) para calcular la relación de intercambio respiratorio.

Después de completar la visita inicial en la que se establecieron las medidas de referencia de la síntesis de proteínas musculares y la descomposición de las proteínas de las piernas en respuesta a la alimentación, comenzará el período de intervención farmacológica de 12 semanas. Al finalizar la intervención de 12 semanas, se repetirá la visita de estudio descrita anteriormente para determinar los efectos de la intervención en las medidas de resultado enumeradas.

Coleccion de muestra:

Al comienzo de cada visita experimental, se recolectarán 8 ml de sangre de una cánula venosa en vacutainers de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Después de la centrifugación a 4 °C, el plasma extraído se almacenará a -80 °C para permitir la determinación posterior de los niveles circulantes de citocinas seleccionadas. Durante el pinzamiento de insulina se obtendrá 1 ml de sangre A-V cada 5 min para la monitorización de la concentración de glucosa en sangre (YSI 2300 STATplus, Yellow Springs Instruments, USA). Se recolectará sangre A-V (5 ml) al inicio y a +30, +75, +90, +105, +120, +150, +195, +210, +225, +240 min, se dejará coagular, centrifugar, y el suero almacenado en nitrógeno líquido. La insulina se medirá en estas muestras en una fecha posterior con un kit de radioinmunoensayo (Coat-a-Count Insulin, EE. UU.). Se tomarán muestras de sangre venosa femoral y A-V (2 ml) para mediciones de trazador de sangre a -5, +75, +90, +105, +120, +195, +210, +225, +240 min, centrifugadas a 4° C y almacenado a -80°C. Se obtendrán biopsias musculares del músculo vasto lateral a los 0, +120 y +240 min utilizando la técnica de biopsia percutánea con aguja. Las muestras de músculo se congelarán instantáneamente en nitrógeno líquido antes de la determinación de la incorporación de [1-13C]leucina.

Cuidado posterior de los sujetos:

La auditoría de los estudios anteriores del investigador sobre biopsias musculares y procedimientos de canulación ha demostrado que los sujetos toleran bien los procedimientos y tienen pocas complicaciones significativas. La cicatrización de la piel es mínima e invisible después de unos meses. Todas las biopsias musculares se obtienen en condiciones estériles por personal médico calificado y después de la inyección de anestesia local. Todos los sujetos son monitoreados cuidadosamente antes, durante y después del procedimiento para asegurar que estén cómodos en todo momento. Después de cada biopsia, la piel se cierra con una tira adhesiva estéril y se cubre con un apósito adhesivo impermeable. Al retirar las cánulas, se aplica presión para detener el sangrado y los sitios se revisten con un vendaje adhesivo impermeable. Los sujetos reciben un folleto antes de salir del laboratorio que contiene información sobre el cuidado posterior y los datos de contacto de nuestros médicos en caso de que necesiten asesoramiento. Además, los sujetos serán contactados por teléfono en las semanas 2, 6 y 10 para confirmar la ausencia de efectos adversos de la administración del fármaco. Los sujetos también recibirán detalles de contacto que pueden usar si tienen alguna inquietud.

Mediciones y análisis:

Las muestras de biopsia muscular y las muestras de sangre se medirán para la incorporación del marcador, lo que permitirá calcular las tasas de síntesis y degradación de proteínas musculares. Las muestras de sangre recolectadas se analizarán para determinar los niveles circulantes de citocinas. Al realizar estas mediciones antes y después del tratamiento con pioglitazona, se determinarán las consecuencias de la inflamación en personas de edad avanzada sobre el metabolismo muscular. El análisis estadístico se realizará mediante análisis de varianza (ANOVA).