Effetto delle citochine derivate dall'obesità sul turnover proteico e sul metabolismo dei carboidrati nel muscolo scheletrico umano

Reclutamento dei soggetti:

Verranno reclutati 24 partecipanti obesi (ma altrimenti sani) con livelli elevati di citochine e 24 soggetti non obesi con livelli normali di citochine. Dopo la prima visita sperimentale (vedi sotto), i partecipanti saranno divisi in doppio cieco in quattro gruppi (n=12). In studi precedenti che utilizzavano stati infiammatori simili di basso grado in cui sono stati somministrati tiazolidinedioni, sono state osservate differenze significative ( P <0, 05) nei processi in esame con dimensioni del gruppo di 10. Pertanto, le dimensioni del gruppo di 12 sono state selezionate per accogliere il previsto abbandono del 15% osservato negli studi a lungo termine. I partecipanti saranno maschi, di pari età (> 55 anni), non fumatori, vivranno uno stile di vita sedentario e non vegetariani. Prima di prendere parte allo studio, tutti i soggetti saranno sottoposti a screening medico e completeranno un questionario sulla salute generale. Ciò includerà misure di pressione sanguigna, frequenza cardiaca, elettrocardiogramma a 12 derivazioni (ECG), biochimica del sangue e un profilo di coagulazione del sangue. Per i soggetti non di controllo, l'inclusione nello studio sarà determinata dalle misure della circonferenza della vita (>100 cm) e dello stato infiammatorio (soggetti non obesi con livelli plasmatici di proteine ​​C-reattive (CRP) <1,35 μg.ml-1 e livelli plasmatici di fattore di necrosi tumorale alfa (TNFα) <3,3 pg.ml-1 e soggetti obesi con CRP >1,35 μg.ml-1 e TNFα >4,1 pg.ml-1). Dopo una spiegazione dello studio e delle procedure associate, sarà ottenuto il consenso scritto e i soggetti saranno informati che sono liberi di ritirarsi in qualsiasi momento. I soggetti saranno reclutati tramite annunci stampa dalla popolazione locale.

Prove sperimentali:

All'inizio di uno studio della durata di 12 settimane, la sintesi proteica muscolare e la disgregazione proteica delle gambe saranno determinate in tutti i soggetti mediante la somministrazione di isotopi stabili di leucina e fenilalanina in concomitanza con un clamp di insulina a due stadi per simulare il passaggio dal digiuno al stato nutrito. Questo stabilirà i valori di riferimento per queste misure prima del periodo di intervento di 12 settimane. Queste misure saranno raggiunte in un'unica visita con l'esecuzione di un protocollo stabilito per la determinazione della sintesi proteica muscolare e della disgregazione proteica delle gambe. In sintesi, per raggiungere questo obiettivo verrà eseguita: una biopsia muscolare basale dalla coscia dopo la quale le concentrazioni sieriche di insulina saranno mantenute a livelli a digiuno e un'ulteriore biopsia muscolare ottenuta; una volta assunta, le concentrazioni sieriche di insulina saranno elevate e gli aminoacidi misti saranno somministrati per simulare l'alimentazione, seguita dall'esecuzione di una terza e ultima biopsia muscolare. Il prelievo di biopsie consentirà la determinazione dell'incorporazione degli isotopi e quindi la determinazione della sintesi proteica muscolare e dei tassi di degradazione proteica delle gambe.

Dopo la prima visita sperimentale, i soggetti inizieranno un periodo di trattamento di 12 settimane con pioglitazone (30 mg•giorno-1) o un placebo, somministrato in doppio cieco. I soggetti saranno monitorati a intervalli durante tutto il periodo per garantire la conformità e segnalare effetti collaterali indesiderati. Dopo 12 settimane di somministrazione del farmaco o del placebo, i soggetti torneranno in laboratorio per ripetere le misurazioni determinate nella prima visita sperimentale (sintesi proteica muscolare e scomposizione proteica delle gambe in risposta all'alimentazione simulata). I livelli circolanti di citochine selezionate saranno inoltre esaminati nei campioni di sangue prelevati dai soggetti all'inizio delle due visite sperimentali (periodo di intervento farmacologico pre e post 12 settimane), consentendo così una valutazione di eventuali cambiamenti associati tra le concentrazioni sistemiche di citochine e sintesi proteica muscolare e disgregazione proteica delle gambe.

Protocollo di studio:

Lo studio prevede due visite separate da un periodo di intervento farmacologico di 12 settimane. In ciascuna delle due visite, la sintesi proteica muscolare e i tassi di degradazione proteica delle gambe in risposta all'alimentazione simulata devono essere valutati utilizzando un protocollo sperimentale stabilito descritto di seguito:

Ai soggetti verrà chiesto di astenersi dall'alcol e dall'esercizio fisico per 48 ore prima di ogni visita sperimentale e di arrivare la mattina della visita sperimentale a digiuno. Ai soggetti verrà chiesto di riposare in posizione semi-supina mentre una cannula viene inserita retrograda in una vena superficiale sulla superficie dorsale della mano non dominante per il prelievo di sangue. La mano sarà tenuta in un'unità scaldamani (temperatura dell'aria 50-55°C) per arterializzare il drenaggio venoso della mano. Una cannula sarà posta in una vena antecubitale in ciascun avambraccio per l'infusione di insulina, octreotide, glucosio, aminoacidi e infusioni di isotopi stabili di leucina e fenilalanina per simulare l'alimentazione in modo preciso; un catetere posizionato nella vena femorale consentirà, insieme ai prelievi di sangue arterioso-venoso (A-V), il prelievo di sangue arterioso e venoso attraverso la gamba. Per valutare la sintesi proteica muscolare e i tassi di degradazione proteica delle gambe in risposta all'alimentazione, l'insulina sierica verrà inizialmente mantenuta a concentrazioni a digiuno mediante la somministrazione di insulina (0,6 mU•m-2•min-1) per 120 minuti e, per prevenire l'insulina endogena produzione, octreotide (30 ng•kg-1•min-1). Quindi, per simulare l'alimentazione, le concentrazioni sieriche di insulina saranno aumentate equivalenti allo stato di alimentazione per 120 minuti (~40 mU•l-1) e 20 g di aminoacidi misti (Glamin® Fresenius-Kabi, Regno Unito) somministrati per infusione in combinazione con glucosio per stabilizzare le concentrazioni di glucosio nel sangue (~ 4,5 mmol.l-1). Le infusioni di versioni isotopiche stabili di fenilalanina e leucina saranno mantenute per tutta la durata della visita sperimentale. Inizialmente, sarà somministrata una singola dose iniziale di [2H5]fenilalanina (0,33 mg•kg-1 di massa corporea, 98% di atomi in eccesso) e [1-13C]leucina (0,8 mg•kg-1 di massa corporea, 99% di atomi in eccesso). somministrata, seguita da un'infusione costante di 0,5 mg•kg-1•h-1 fenilalanina e 1,0 mg•kg-1•h-1 leucina. L'uso di questi due isotopi stabili in combinazione con le biopsie muscolari ottenute dal muscolo vasto laterale della gamba a t = 0, 120 e 240 min e il prelievo di sangue durante la visita, consentirà la sintesi proteica muscolare e i tassi di degradazione proteica della gamba in risposta all'alimentazione da calcolare. A intervalli regolari durante il periodo sperimentale, lo scambio gassoso respiratorio sarà monitorato misurando l'assorbimento di ossigeno (O2) e la produzione di anidride carbonica (CO2) utilizzando un calorimetro indiretto a cappa ventilata (NutrEn, UK) per calcolare il rapporto di scambio respiratorio.

Dopo il completamento della visita iniziale in cui sono state stabilite le misure di base della sintesi proteica muscolare e della disgregazione proteica delle gambe in risposta all'alimentazione, inizierà il periodo di intervento farmacologico di 12 settimane. Al termine dell'intervento di 12 settimane, la visita di studio sopra descritta verrà ripetuta per determinare gli effetti dell'intervento sulle misure di esito elencate.

Raccolta campioni:

All'inizio di ogni visita sperimentale, 8 ml di sangue saranno raccolti da una cannula venosa in vacutainer di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Dopo la centrifugazione a 4°C, il plasma estratto sarà conservato a -80°C per consentire la successiva determinazione dei livelli circolanti di citochine selezionate. Durante il clamp insulinico, verrà prelevato 1 ml di sangue A-V ogni 5 minuti per il monitoraggio della concentrazione di glucosio nel sangue (YSI 2300 STATplus, Yellow Springs Instruments, USA). Il sangue A-V (5 ml) sarà raccolto al basale e a +30, +75, +90, +105, +120, +150, +195, +210, +225, +240 min, lasciato coagulare, centrifugato, e il siero conservato in azoto liquido. L'insulina sarà misurata in questi campioni in un secondo momento con un kit di dosaggio radioimmunologico (Coat-a-Count Insulin, USA). Saranno prelevati campioni di sangue venoso femorale e A-V (2 ml) per le misurazioni del tracciante sanguigno a -5, +75, +90, +105, +120, +195, +210, +225, +240 min, centrifugato a 4° C e conservato a -80°C. Le biopsie muscolari saranno ottenute dal muscolo vasto laterale a 0, +120 e +240 min utilizzando la tecnica dell'agobiopsia percutanea. I campioni muscolari saranno congelati in azoto liquido prima della determinazione dell'incorporazione di [1-13C]leucina.

Post-cura dei soggetti:

L'audit degli studi precedenti dello sperimentatore che coinvolgevano biopsie muscolari e procedure di incannulamento ha dimostrato che le procedure sono ben tollerate dai soggetti e presentano poche complicanze significative. Le cicatrici della pelle sono minime e invisibili dopo pochi mesi. Tutte le biopsie muscolari sono ottenute in condizioni sterili da personale medico qualificato e dopo l'iniezione di anestetico locale. Tutti i soggetti vengono attentamente monitorati prima, durante e dopo la procedura per garantire che siano sempre a loro agio. Dopo ogni biopsia, la pelle viene chiusa con una striscia adesiva sterile e coperta con una medicazione adesiva impermeabile. Dopo la rimozione delle cannule, viene applicata pressione per arrestare il sanguinamento e i siti rivestiti con una medicazione adesiva impermeabile. Ai soggetti viene consegnato un opuscolo prima di lasciare il laboratorio contenente informazioni post-terapia e dettagli di contatto dei nostri medici qualora avessero bisogno di consigli. Inoltre, i soggetti saranno contattati telefonicamente nelle settimane 2, 6 e 10 per confermare l'assenza di effetti avversi della somministrazione del farmaco. Ai soggetti verranno inoltre forniti i dettagli di contatto che possono utilizzare in caso di dubbi.

Misure e analisi:

I campioni di biopsia muscolare ei campioni di sangue devono essere misurati per l'incorporazione del tracciante, consentendo di calcolare i tassi di sintesi e scomposizione delle proteine ​​muscolari. I campioni di sangue raccolti saranno analizzati per i livelli circolanti di citochine. Eseguendo queste misurazioni prima e dopo il trattamento con pioglitazone, saranno determinate le conseguenze dell'infiammazione nei soggetti anziani sul metabolismo muscolare. L'analisi statistica deve essere eseguita utilizzando l'analisi della varianza (ANOVA).