Liikalihavuudesta peräisin olevien sytokiinien vaikutus proteiinien kiertoon ja hiilihydraattien aineenvaihduntaan ihmisen luustolihaksessa

Aiheiden rekrytointi:

Rekrytoidaan 24 lihavaa (mutta muuten tervettä) osallistujaa, joiden sytokiinitasot ovat kohonneet, ja 24 ei-lihavaa henkilöä, joilla on normaali sytokiinitaso. Ensimmäisen kokeellisen vierailun jälkeen (katso alla) osallistujat jaetaan kaksoissokkoutettuna neljään ryhmään (n=12). Aiemmissa tutkimuksissa, joissa käytettiin samanlaisia ​​matala-asteisia tulehdustiloja, joissa on annettu tiatsolidiinidioneja, on havaittu merkittäviä eroja (P < 0,05) tutkittavissa prosesseissa 10:n ryhmäkoolla. Siksi 12 hengen ryhmäkoot on valittu vastaamaan odotettavissa olevaa 15 %:n keskeyttämistä, joka on havaittu pitkäaikaisissa tutkimuksissa. Osallistujat ovat miehiä, samanikäisiä (>55-vuotiaita), tupakoimattomia, istuvaa elämäntapaa ja ei-kasvissyöjiä. Ennen tutkimukseen osallistumista kaikki koehenkilöt käyvät läpi lääkärintarkastuksen ja täyttävät yleisen terveyskyselyn. Tämä sisältää verenpaineen, sykkeen, 12-kytkentäisen elektrokardiogrammin (EKG), veren biokemian ja veren hyytymisprofiilin mittaukset. Muiden kuin kontrollihenkilöiden tutkimukseen osallistuminen määritetään vyötärön ympärysmitan (> 100 cm) ja tulehduksellisen tilan (ei-lihavat, joiden plasman C-reaktiivisten proteiinien (CRP) taso on < 1,35 µg.ml-1 ja tuumorinekroositekijä-alfa (TNFα) plasmatasot <3,3 pg.ml-1 ja liikalihavia henkilöitä, joiden CRP >1,35 μg.ml-1 ja TNFα >4,1 pg.ml-1). Tutkimuksen ja siihen liittyvien menettelyjen selityksen jälkeen hankitaan kirjallinen suostumus ja koehenkilöille ilmoitetaan, että he voivat peruuttaa sen milloin tahansa. Kohteita rekrytoidaan paikallisväestön lehdistöilmoituksilla.

Kokeet:

12 viikkoa kestävän tutkimuksen alussa kaikilla koehenkilöillä määritetään lihasproteiinisynteesi ja jalkojen proteiinien hajoaminen antamalla leusiinin ja fenyylialaniinin stabiileja isotooppeja samanaikaisesti kaksivaiheisen insuliinipuristimen kanssa simuloimaan siirtymistä paastotilasta ruokittu osavaltio. Tämä määrittää näiden toimenpiteiden perusarvot ennen 12 viikon interventiojaksoa. Nämä toimenpiteet saavutetaan yhdellä käynnillä noudattamalla vakiintunutta protokollaa lihasproteiinisynteesin ja jalkaproteiinien hajoamisen määrittämiseksi. Yhteenvetona tämän saavuttamiseksi suoritetaan seuraava: otetaan tyvilihasbiopsia reidestä, jonka jälkeen seerumin insuliinipitoisuudet pidetään paastotasoilla ja otetaan lisälihasbiopsia; kerran otettu seerumin insuliinipitoisuudet nostetaan ja sekoitetut aminohapot annetaan simuloidakseen ruokintaa, minkä jälkeen otetaan kolmas ja viimeinen lihasbiopsia. Biopsioiden ottaminen mahdollistaa isotooppien sisällyttämisen ja siten lihasproteiinisynteesin ja jalkaproteiinien hajoamisnopeuden määrittämisen.

Ensimmäisen koekäynnin jälkeen koehenkilöt aloittavat 12 viikon pituisen pioglitatsonin (30 mg•day-1) tai lumelääkehoidon kaksoissokkomenetelmällä. Koehenkilöitä seurataan säännöllisin väliajoin koko jakson ajan noudattamisen varmistamiseksi ja ei-toivottujen sivuvaikutusten raportoimiseksi. 12 viikon lääkkeen tai lumelääkkeen antamisen jälkeen koehenkilöt palaavat laboratorioon toistamaan ensimmäisellä koekäynnillä määritetyt mittaukset (lihasproteiinisynteesi ja jalkaproteiinien hajoaminen vasteena simuloituun ruokitukseen). Valittujen sytokiinien kiertävät tasot tutkitaan lisäksi verinäytteistä, jotka on kerätty koehenkilöiltä kahden koekäynnin alussa (ennen ja jälkeen 12 viikon lääkeinterventiojakson), mikä mahdollistaa mahdollisten siihen liittyvien muutosten arvioinnin systeemisten sytokiinipitoisuuksien ja lihasproteiinisynteesi ja jalkaproteiinien hajoaminen.

Tutkimusprotokolla:

Tutkimus käsittää kaksi käyntiä, joita erottaa 12 viikon huumeinterventiojakso. Jokaisella kahdella käynnillä lihasproteiinisynteesi ja jalkaproteiinien hajoamisnopeudet simuloidun ruokinnan seurauksena on arvioitava käyttämällä alla kuvattua vakiintunutta kokeellista protokollaa:

Koehenkilöitä pyydetään pidättäytymään alkoholista ja liikunnasta 48 tuntia ennen jokaista koekäyntiä ja saapumaan koekäynnin aamuna paastotilassa. Koehenkilöitä pyydetään lepäämään puoliksi makuuasennossa, kun kanyyli työnnetään taaksepäin ei-dominoivan käden selkäpinnalla olevaan pintalaskimoon verinäytteitä varten. Käsiä säilytetään käsien lämmitysyksikössä (ilman lämpötila 50-55°C) käden laskimovirtauksen arterialisoimiseksi. Kanyyli asetetaan kumpaankin kyynärvarteen antecubitaaliseen laskimoon insuliinin, oktreotidin, glukoosin, aminohappojen ja leusiinin ja fenyylialaniinin stabiilien isotooppi-infuusioiden infuusiota varten, jotta voidaan simuloida ruokintaa tarkasti. reisilaskimoon asetettu katetri mahdollistaa valtimolaskimoverinäytteiden (A-V) yhteydessä valtimo- ja laskimoverinäytteen ottamisen jalan poikki. Lihasproteiinisynteesin ja jalkojen proteiinien hajoamisnopeuksien arvioimiseksi vasteena ruokinnasta, seerumin insuliinia pidetään aluksi paastopitoisuuksissa antamalla insuliinia (0,6 mU•m-2•min-1) 120 minuutin ajan ja endogeenisen insuliinin estämiseksi. tuotanto, oktreotidi (30 ng•kg-1•min-1). Sitten ruokinnan simuloimiseksi seerumin insuliinipitoisuuksia nostetaan vastaamaan ruokailutilaa 120 minuutin ajan (~40 mU•l-1) ja 20 g aminohapposekoituksia (Glamin® Fresenius-Kabi, UK) annetaan infuusiona yhdessä glukoosia verenglukoosipitoisuuksien stabiloimiseksi (~4,5 mmol.l-1). Fenyylialaniinin ja leusiinin stabiilien isotooppiversioiden infuusiota ylläpidetään koko koekäynnin ajan. Aluksi annetaan kerta-annos [2H5]fenyylialaniinia (0,33 mg•kg-1 ruumiinmassaa, 98 atomin % ylimäärä) ja [1-13C]leusiinia (0,8 mg•kg-1 ruumiinmassaa, 99 atomi% ylimäärää). 0,5 mg•kg-1•h-1 fenyylialaniinia ja 1,0 mg•kg-1•h-1 leusiinia. Näiden kahden stabiilin isotoopin käyttö yhdessä jalan vastus lateralis -lihaksesta t = 0, 120 ja 240 min saatujen lihasbiopsioiden kanssa ja verinäytteiden ottaminen koko käynnin ajan mahdollistaa lihasproteiinisynteesin ja jalkaproteiinien hajoamisnopeudet vasteena. ruokinta laskettava. Säännöllisin väliajoin koko koejakson ajan hengityskaasun vaihtoa seurataan mittaamalla hapen (O2) ottoa ja hiilidioksidin (CO2) tuotantoa käyttämällä tuuletettua huppua epäsuoraa kalorimetriä (NutrEn, UK) hengitysteiden vaihtosuhteen laskemiseksi.

Ensimmäisen käynnin jälkeen, jossa lihasproteiinisynteesin ja jalkojen proteiinin hajoamisen perusmittaukset ruokinnan seurauksena on määritetty, alkaa 12 viikon lääkeinterventiojakso. 12 viikon toimenpiteen päätyttyä yllä kuvattu opintokäynti toistetaan, jotta voidaan määrittää toimenpiteen vaikutukset lueteltuihin tulosmittauksiin.

Näytekokoelma:

Jokaisen kokeellisen käynnin alussa kerätään 8 ml verta laskimokanyylistä etyleenidiamiinitetraetikkahappo (EDTA) -vacutainersiin. 4 °C:ssa sentrifugoinnin jälkeen uutettua plasmaa säilytetään -80 °C:ssa, jotta valikoitujen sytokiinien verenkierrossa olevat tasot voidaan myöhemmin määrittää. Insuliinipuristimen aikana otetaan 1 ml A-V verta 5 minuutin välein verensokeripitoisuuden seurantaa varten (YSI 2300 STATplus, Yellow Springs Instruments, USA). A-V-veri (5 ml) kerätään lähtötilanteessa ja +30, +75, +90, +105, +120, +150, +195, +210, +225, +240 min, annetaan hyytyä, sentrifugoidaan, ja seerumi, joka säilytetään nestetypessä. Insuliini mitataan näistä näytteistä myöhemmin radioimmunomäärityspakkauksella (Coat-a-Count Insulin, USA). Reisilaskimo- ja A-V-verinäytteet (2 ml) otetaan verimerkkimittauksia varten -5, +75, +90, +105, +120, +195, +210, +225, +240 min, sentrifugoidaan 4°:ssa. C ja säilytetään -80 °C:ssa. Lihasbiopsiat otetaan vastus lateralis -lihaksesta 0, +120 ja +240 minuutin kohdalla käyttäen perkutaanista neulabiopsiatekniikkaa. Lihasnäytteet pikapakastetaan nestetypessä ennen [1-13C]leusiinin sitoutumisen määrittämistä.

Koehenkilöiden jälkihoito:

Tutkijan aiempien lihasbiopsioiden ja kanylointitoimenpiteiden tarkastaminen on osoittanut, että koehenkilöt sietävät toimenpiteet hyvin ja niillä on vain vähän merkittäviä komplikaatioita. Ihon arpeutuminen on vähäistä ja näkymätöntä muutaman kuukauden kuluttua. Lääketieteellisesti pätevä henkilökunta ottaa kaikki lihaskoepalat steriileissä olosuhteissa paikallispuudutuksen injektion jälkeen. Kaikkia koehenkilöitä seurataan huolellisesti ennen toimenpidettä, sen aikana ja sen jälkeen sen varmistamiseksi, että he tuntevat olonsa mukavaksi koko ajan. Jokaisen biopsian jälkeen iho suljetaan steriilillä liimanauhalla ja peitetään vedenpitävällä liimasidoksella. Kanyylit poistettaessa painetaan verenvuodon pysäyttämiseksi ja kohdat sidotaan vedenpitävällä liimasidoksella. Koehenkilöille annetaan ennen laboratoriosta lähtöä esite, joka sisältää tiedot jälkihoidosta ja kliinikoidemme yhteystiedot, jos he tarvitsevat neuvoja. Lisäksi koehenkilöihin otetaan yhteyttä puhelimitse viikoilla 2, 6 ja 10 sen varmistamiseksi, että lääkkeen antamisella ei ole haitallisia vaikutuksia. Tutkittaville annetaan myös yhteystiedot, joita he voivat käyttää, jos heillä on kysyttävää.

Mittaukset ja analyysit:

Lihasbiopsianäytteet ja verinäytteet on mitattava merkkiaineen sisällyttämisen varalta, jolloin voidaan laskea lihasproteiinisynteesin ja hajoamisen nopeus. Kerätyt verinäytteet analysoidaan verenkierrossa olevien sytokiinien määrittämiseksi. Suorittamalla nämä mittaukset ennen ja jälkeen pioglitatsonihoitoa selvitetään ikääntyneiden henkilöiden tulehduksen vaikutukset lihasaineenvaihduntaan. Tilastollinen analyysi on suoritettava käyttämällä varianssianalyysiä (ANOVA).