비만유래 사이토카인이 인체 골격근의 단백질 전환율과 탄수화물 대사에 미치는 영향

과목 모집:

높은 사이토카인 수치를 가진 24명의 비만(하지만 건강한) 참가자와 정상 사이토카인 수치를 가진 24명의 비만하지 않은 피험자가 모집됩니다. 첫 번째 실험 방문(아래 참조) 후 참가자는 이중 맹검 방식으로 4개 그룹(n=12)으로 나뉩니다. 티아졸리딘디온이 투여된 유사한 저등급 염증 상태를 활용한 이전 연구에서 조사 중인 과정에서 유의미한 차이(P<0.05)가 그룹 크기 10에서 관찰되었습니다. 따라서 장기 연구에서 볼 수 있는 예상되는 15% 탈락을 수용하기 위해 그룹 크기 12개를 선택했습니다. 참가자는 남성, 연령 일치(>55세), 비흡연자, 좌식 생활 방식 및 비채식주의자입니다. 연구에 참여하기 전에 모든 피험자는 건강 검진을 받고 일반 건강 설문지를 작성합니다. 여기에는 혈압, 심박수, 12-리드 심전도(ECG), 혈액 생화학 및 혈액 응고 프로파일 측정이 포함됩니다. 대조군이 아닌 피험자의 경우 허리 둘레(>100cm) 및 염증 상태(C-반응성 단백질(CRP) 혈장 수준이 1.35μg.ml-1 미만인 비비만 피험자 및 종양 괴사 인자-알파(TNFα) 혈장 수치 <3.3 pg.ml-1 및 CRP >1.35 μg.ml-1 및 TNFα >4.1 pg.ml-1를 갖는 비만 피험자). 연구 및 관련 절차에 대한 설명 후 서면 동의를 얻고 피험자는 언제든지 철회할 수 있음을 알립니다. 주제는 지역 인구의 언론 광고를 통해 모집됩니다.

실험적 시도:

12주간의 긴 연구를 시작할 때, 근육 단백질 합성 및 다리 단백질 분해는 2단계 인슐린 클램프에 수반되는 류신 및 페닐알라닌의 안정 동위원소 투여를 통해 모든 피험자에서 결정되어 단식에서 정상으로 가는 것을 시뮬레이션합니다. 먹은 상태. 이렇게 하면 12주 개입 기간 전에 이러한 측정에 대한 기준 값이 설정됩니다. 이러한 조치는 근육 단백질 합성 및 다리 단백질 분해를 결정하기 위해 확립된 프로토콜을 실행하여 단일 방문으로 달성됩니다. 요약하면, 이를 달성하기 위해 다음이 수행될 것입니다: 허벅지에서 기초 근육 생검을 얻은 후 혈청 인슐린 농도를 공복 수준으로 유지하고 추가 근육 생검을 얻습니다. 일단 복용하면 혈청 인슐린 농도를 높이고 혼합 아미노산을 투여하여 수유를 시뮬레이션한 다음 세 번째 및 최종 근육 생검을 실시합니다. 생검을 통해 동위원소 통합을 결정할 수 있고 따라서 근육 단백질 합성 및 다리 단백질 분해율을 결정할 수 있습니다.

첫 번째 실험 방문 후 피험자는 이중 맹검 방식으로 투여된 피오글리타존(30 mg•day-1) 또는 위약의 12주 치료 기간을 시작합니다. 준수 여부를 확인하고 원치 않는 부작용을 보고하기 위해 피험자는 기간 동안 간격을 두고 모니터링됩니다. 약물 또는 위약 투여 12주 후 피험자는 첫 번째 실험 방문에서 결정된 측정을 반복하기 위해 실험실로 돌아갑니다(모의 수유에 대한 반응으로 근육 단백질 합성 및 다리 단백질 분해). 선택 사이토카인의 순환 수준은 두 번의 실험 방문 시작 시(전후 12주 약물 개입 기간) 피험자로부터 수집한 혈액 샘플에서 추가로 검사되어 전신 사이토카인 농도와 근육 단백질 합성 및 다리 단백질 분해.

연구 프로토콜:

이 연구는 12주의 약물 개입 기간으로 분리된 두 번의 방문을 포함합니다. 2번의 방문 각각에서 모의 ​​섭식에 대한 반응으로 근육 단백질 합성 및 다리 단백질 분해율을 아래에 설명된 확립된 실험 프로토콜을 사용하여 평가해야 합니다.

피험자는 각 실험 방문 전 48시간 동안 술과 운동을 삼가하고 실험 방문 아침에 금식 상태로 도착하도록 요청받을 것입니다. 채혈을 위해 비주요 손의 등쪽 표면에 있는 표재성 정맥에 캐뉼라를 삽입하는 동안 피험자는 반누운 자세로 휴식을 취하도록 요청받습니다. 손은 손의 정맥 배액을 동맥화하기 위해 손을 따뜻하게 하는 장치(공기 온도 50-55°C)에 보관됩니다. 인슐린, 옥트레오타이드, 포도당, 아미노산 및 류신과 페닐알라닌의 안정 동위원소 주입을 위해 각 팔뚝의 팔뚝 정맥에 캐뉼러를 배치하여 정확한 방식으로 먹이를 시뮬레이션합니다. 대퇴 정맥에 삽입된 카테터는 동맥화 정맥(A-V) 혈액 샘플과 함께 다리 전체의 동맥 및 정맥 혈액 샘플링을 허용합니다. 섭식에 대한 반응으로 근육 단백질 합성 및 다리 단백질 분해율을 평가하기 위해 혈청 인슐린은 초기에 120분 동안 인슐린(0.6 mU•m-2•min-1)을 투여하여 공복 농도로 유지되고 내인성 인슐린을 예방하기 위해 생산, Octreotide (30 ng•kg-1•min-1). 그런 다음 섭식을 시뮬레이션하기 위해 혈청 인슐린 농도를 120분 동안 섭식 상태와 동일하게 증가시키고(~40mU•l-1) 20g의 혼합 아미노산(Glamin® Fresenius-Kabi, UK)을 주입으로 투여합니다. 혈당 농도를 안정화하기 위한 포도당(~4.5mmol.l-1). 페닐알라닌 및 류신의 안정한 동위원소 버전의 주입은 실험 방문 내내 유지될 것입니다. 초기에 [2H5]페닐알라닌(체질량 0.33mg•kg-1, 98원자 % 과량)과 [1-13C]류신(체질량 0.8mg•kg-1, 99원자 % 과량)의 단일 프라이밍 용량이 0.5 mg•kg-1•h-1 페닐알라닌과 1.0 mg•kg-1•h-1 류신을 지속적으로 주입합니다. t = 0, 120 및 240분에 다리의 외측광근에서 얻은 근육 생검과 방문 기간 내내 혈액 샘플링과 함께 이 두 가지 안정 동위원소를 사용하면 근육 단백질 합성 및 다리 단백질 분해 속도가 반응할 수 있습니다. 계산할 수유. 실험 기간 동안 일정한 간격으로 환기 후드 간접 열량계(NutrEn, UK)를 사용하여 산소(O2) 흡수 및 이산화탄소(CO2) 생성을 측정하여 호흡 가스 교환을 모니터링하여 호흡 교환 비율을 계산합니다.

수유에 대한 반응으로 근육 단백질 합성 및 다리 단백질 분해의 기준 측정이 확립된 초기 방문 완료 후 12주의 약물 개입 기간이 시작됩니다. 12주 중재가 완료되면 나열된 결과 측정에 대한 중재의 효과를 결정하기 위해 위에 설명된 연구 방문이 반복됩니다.

샘플 수집:

각 실험 방문 시작 시 정맥 캐뉼라에서 EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 진공채혈기로 8ml의 혈액을 채취합니다. 4°C에서 원심분리한 후 추출된 혈장을 -80°C에 보관하여 나중에 순환하는 특정 사이토카인 수준을 결정할 수 있습니다. 인슐린 클램프 동안 혈당 농도 모니터링을 위해 5분마다 A-V 혈액 1ml를 채취합니다(YSI 2300 STATplus, Yellow Springs Instruments, USA). A-V 혈액(5ml)은 기준선 및 +30, +75, +90, +105, +120, +150, +195, +210, +225, +240분에 수집되고, 응고되고, 원심분리되고, 액체 질소에 저장된 혈청. 인슐린은 나중에 방사선 면역분석 키트(Coat-a-Count Insulin, USA)를 사용하여 이들 샘플에서 측정될 것입니다. 혈액 추적자 측정을 위해 대퇴 정맥 및 A-V 혈액 샘플(2ml)을 -5, +75, +90, +105, +120, +195, +210, +225, +240분, 4°에서 원심분리하여 채취합니다. C 및 -80°C에서 보관. 경피 바늘 생검 기술을 사용하여 0, +120 및 +240분에 외측광근으로부터 근육 생검을 얻을 것입니다. 근육 샘플은 [1-13C]류신 통합을 결정하기 전에 액체 질소에서 급속 동결됩니다.

피험자 사후 관리:

근육 생검 및 캐뉼라 시술을 포함하는 연구자의 과거 연구를 감사한 결과 피험자가 절차를 잘 견뎌내고 중요한 합병증이 거의 없는 것으로 나타났습니다. 피부의 흉터는 최소화되고 몇 달 후에는 보이지 않습니다. 모든 근육 생검은 의학적으로 자격을 갖춘 직원에 의해 무균 상태에서 국소 마취 주사 후 이루어집니다. 모든 피험자는 시술 전, 도중 및 후에 주의 깊게 모니터링하여 항상 편안함을 느낄 수 있도록 합니다. 각 생검 후 멸균 접착 스트립으로 피부를 닫고 방수 접착 드레싱으로 덮습니다. 캐뉼라를 제거할 때 출혈을 멈추기 위해 압력을 가하고 방수 접착 드레싱으로 부위를 감쌉니다. 연구실을 떠나기 전에 피험자에게 애프터 케어 정보와 조언이 필요한 임상의의 연락처 정보가 포함된 전단지가 제공됩니다. 또한 피험자는 2주, 6주 및 10주에 전화로 연락하여 약물 투여의 부작용이 없는지 확인합니다. 피험자에게는 우려 사항이 있는 경우 사용할 수 있는 연락처 정보도 제공됩니다.

측정 및 분석:

근육 생검 샘플 및 혈액 샘플은 트레이서 통합을 위해 측정되어야 하며, 근육 단백질 합성 및 분해 속도를 계산할 수 있습니다. 수집된 혈액 샘플은 순환 수준의 사이토카인에 대해 분석됩니다. 피오글리타존 치료 전후에 이러한 측정을 수행함으로써 근육 대사에 대한 노인의 염증 결과를 결정할 수 있습니다. 통계 분석은 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 수행되어야 합니다.