Влияние цитокинов, происходящих из-за ожирения, на обмен белков и метаболизм углеводов в скелетных мышцах человека

Набор предметов:

Будут набраны 24 участника с ожирением (но в остальном здоровые) с повышенным уровнем цитокинов и 24 субъекта без ожирения с нормальным уровнем цитокинов. После первого экспериментального визита (см. ниже) участники будут разделены двойным слепым методом на четыре группы (n = 12). В предыдущих исследованиях с использованием сходных воспалительных состояний слабой степени, когда вводились тиазолидиндионы, наблюдались значительные различия (P<0,05) в исследуемых процессах при размере группы 10. Поэтому были выбраны группы из 12 человек, чтобы учесть ожидаемое 15% отсева, наблюдаемое в долгосрочных исследованиях. Участники будут мужчины, соответствующего возраста (> 55 лет), некурящие, ведущие малоподвижный образ жизни и невегетарианцы. Перед тем, как принять участие в исследовании, все испытуемые пройдут медицинский осмотр и заполнят анкету общего состояния здоровья. Это будет включать измерения артериального давления, частоты сердечных сокращений, электрокардиограмму (ЭКГ) в 12 отведениях, биохимию крови и профиль свертывания крови. Для субъектов, не входящих в контрольную группу, включение в исследование будет определяться измерением окружности талии (> 100 см) и воспалительным статусом (субъекты без ожирения с уровнем С-реактивного белка (СРБ) в плазме <1,35 мкг/мл и уровни фактора некроза опухоли-альфа (TNFα) в плазме <3,3 пг/мл и субъекты с ожирением с CRP>1,35 мкг/мл и TNFα>4,1 пг/мл). После объяснения исследования и связанных с ним процедур будет получено письменное согласие, а субъекты уведомлены о том, что они могут отказаться от участия в любой момент. Субъекты будут набираться по объявлениям в прессе от местного населения.

Экспериментальные испытания:

В начале 12-недельного исследования синтез мышечного белка и расщепление белков ног будут определяться у всех испытуемых посредством введения стабильных изотопов лейцина и фенилаланина одновременно с двухступенчатым инсулиновым зажимом, чтобы имитировать переход от голодания к федеральное государство. Это позволит установить базовые значения для этих показателей до 12-недельного периода вмешательства. Эти меры будут достигнуты за одно посещение с выполнением установленного протокола для определения синтеза мышечного белка и расщепления белков ног. Таким образом, для достижения этого будет выполнено следующее: будет получена биопсия базальной мышцы бедра, после чего концентрация инсулина в сыворотке будет поддерживаться на уровне натощак, и будет получена дополнительная биопсия мышцы; после взятия концентрация инсулина в сыворотке будет повышена, и будут введены смешанные аминокислоты для имитации кормления с последующим взятием третьей и последней биопсии мышц. Взятие биоптатов позволит определить включение изотопа и, таким образом, определить синтез мышечного белка и скорость распада белков ног.

После первого экспериментального визита испытуемые начнут 12-недельный период лечения либо пиоглитазоном (30 мг•день-1), либо плацебо, вводимым двойным слепым методом. Субъекты будут контролироваться через определенные промежутки времени в течение всего периода, чтобы обеспечить соблюдение и сообщать о нежелательных побочных эффектах. После 12 недель приема препарата или плацебо испытуемые вернутся в лабораторию для повторения измерений, определенных при первом экспериментальном посещении (синтез мышечного белка и расщепление белков ног в ответ на имитацию питания). Уровни циркулирующих некоторых цитокинов будут дополнительно исследованы в образцах крови, взятых у субъектов в начале двух экспериментальных визитов (до и после 12-недельного периода лекарственного вмешательства), что позволит оценить любые связанные изменения между системными концентрациями цитокинов и синтез мышечного белка и расщепление белков ног.

Протокол исследования:

Исследование включает два визита, разделенных 12-недельным периодом медикаментозного вмешательства. При каждом из двух посещений следует оценивать скорость синтеза мышечного белка и расщепления белков ног в ответ на имитацию кормления с использованием установленного экспериментального протокола, описанного ниже:

Субъектам будет предложено воздерживаться от алкоголя и физических упражнений в течение 48 часов до каждого экспериментального визита и приходить утром в экспериментальный визит натощак. Субъектам будет предложено отдохнуть в полулежачем положении, пока канюля вводится ретроградно в поверхностную вену на тыльной поверхности недоминантной руки для забора крови. Рука будет находиться в грелке для рук (температура воздуха 50-55°C) для артериализации венозного оттока руки. Канюля будет помещена в антекубитальную вену на каждом предплечье для вливания инсулина, октреотида, глюкозы, аминокислот и вливания стабильных изотопов лейцина и фенилаланина для точной имитации кормления; катетер, помещенный в бедренную вену, позволит, в сочетании с образцами артериализованной венозной (AV) крови, взять образцы артериальной и венозной крови через ногу. Для оценки синтеза мышечного белка и скорости расщепления белка ног в ответ на кормление сывороточный инсулин первоначально будет поддерживаться на уровне концентрации натощак путем введения инсулина (0,6 мЕ•м-2•мин-1) в течение 120 минут и для предотвращения эндогенного инсулина. производство, Октреотид (30 нг•кг-1•мин-1). Затем, чтобы имитировать кормление, концентрация инсулина в сыворотке будет увеличена, эквивалентна состоянию сытости, в течение 120 минут (~40 мЕд•л-1) и 20 г смешанных аминокислот (Glamin® Fresenius-Kabi, Великобритания), введенных путем инфузии в сочетании с глюкоза для стабилизации концентрации глюкозы в крови (~4,5 ммоль.л-1). Инфузии стабильных изотопов фенилаланина и лейцина будут поддерживаться на протяжении всего экспериментального визита. Первоначально однократная начальная доза [2H5]фенилаланина (0,33 мг•кг-1 массы тела, избыток 98 ат. %) и [1-13C]лейцина (0,8 мг•кг-1 массы тела, 99 ат. % избытка) будет с последующей постоянной инфузией 0,5 мг•кг-1•ч-1 фенилаланина и 1,0 мг•кг-1•ч-1 лейцина. Использование этих двух стабильных изотопов в сочетании с мышечными биоптатами, полученными из латеральной широкой мышцы голени при t = 0, 120 и 240 мин, и забором крови на протяжении всего визита позволит обеспечить синтез мышечного белка и скорость распада белков голени в ответ. на кормление рассчитываться. Через регулярные промежутки времени в течение экспериментального периода будет контролироваться дыхательный газообмен путем измерения поглощения кислорода (O2) и производства углекислого газа (CO2) с использованием непрямого калориметра с вентилируемым колпаком (NutrEn, Великобритания) для расчета коэффициента дыхательного обмена.

После завершения начального визита, когда были установлены базовые показатели синтеза мышечного белка и расщепления белков ног в ответ на кормление, начнется 12-недельный период медикаментозного вмешательства. По завершении 12-недельного вмешательства описанный выше ознакомительный визит будет повторен, чтобы определить влияние вмешательства на перечисленные показатели результатов.

Сбор образцов:

В начале каждого экспериментального визита 8 мл крови будут собирать из венозной канюли в вакутейнеры с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА). После центрифугирования при 4°C извлеченная плазма будет храниться при температуре -80°C, чтобы можно было в дальнейшем определить циркулирующие уровни некоторых цитокинов. Во время инсулинового клэмпа каждые 5 минут будет браться 1 мл крови из аорты и вен для контроля концентрации глюкозы в крови (YSI 2300 STATplus, Yellow Springs Instruments, США). A-V кровь (5 мл) будет собрана на исходном уровне и при +30, +75, +90, +105, +120, +150, +195, +210, +225, +240 мин, оставлена ​​для свертывания, центрифугирована, и сыворотку хранят в жидком азоте. Инсулин будет измерен в этих образцах позднее с помощью набора для радиоиммуноанализа (Coat-a-Count Insulin, США). Образцы бедренной вены и крови AV (2 мл) будут взяты для измерения индикаторов крови при -5, +75, +90, +105, +120, +195, +210, +225, +240 мин, центрифугированы при 4°. С и хранят при -80°С. Мышечные биопсии будут получены из латеральной широкой мышцы бедра на 0, +120 и +240 мин с использованием техники чрескожной биопсии иглы. Образцы мышц быстро замораживают в жидком азоте перед определением включения [1-13C]лейцина.

Последующий уход за предметами:

Проверка прошлых исследований исследователя, включающих биопсию мышц и процедуры катетеризации, показала, что эти процедуры хорошо переносятся субъектами и вызывают мало серьезных осложнений. Рубцы на коже минимальны и незаметны через несколько месяцев. Все биопсии мышц получаются в стерильных условиях квалифицированным медицинским персоналом и после инъекции местного анестетика. Все пациенты находятся под тщательным наблюдением до, во время и после процедуры, чтобы убедиться, что им все время комфортно. После каждой биопсии кожу закрывают стерильной лейкопластырем и покрывают водонепроницаемой липкой повязкой. После извлечения канюли накладывают давление для остановки кровотечения и накладывают водостойкую лейкопластырную повязку. Перед тем, как покинуть лабораторию, субъектам выдается листовка, содержащая информацию о последующем уходе и контактные данные наших врачей, если им понадобится совет. Кроме того, с субъектами свяжутся по телефону на 2, 6 и 10 неделе, чтобы подтвердить отсутствие каких-либо побочных эффектов от введения лекарственного средства. Субъектам также будет предоставлена ​​​​контактная информация, которую они могут использовать, если у них возникнут какие-либо проблемы.

Измерения и анализ:

Образцы мышечной биопсии и образцы крови должны быть измерены на предмет включения индикатора, что позволит рассчитать скорость синтеза и распада мышечного белка. Собранные образцы крови будут проанализированы на уровень циркулирующих цитокинов. Выполняя эти измерения до и после лечения пиоглитазоном, будут определяться последствия воспаления у пожилых людей для мышечного метаболизма. Статистический анализ проводят с использованием дисперсионного анализа (ANOVA).