Vliv cytokinů pocházejících z obezity na obrat bílkovin a metabolismus sacharidů v lidském kosterním svalu

Nábor subjektů:

Bude přijato 24 obézních (ale jinak zdravých) účastníků se zvýšenými hladinami cytokinů a 24 neobézních subjektů s normálními hladinami cytokinů. Po první experimentální návštěvě (viz níže) budou účastníci rozděleni dvojitě zaslepeným způsobem do čtyř skupin (n=12). V předchozích studiích využívajících podobné zánětlivé stavy nízkého stupně, kde byly podávány thiazolidindiony, byly pozorovány významné rozdíly (P<0,05) ve zkoumaných procesech při velikosti skupin 10. Proto byly vybrány velikosti skupin 12, aby vyhovovaly očekávanému 15% vynechání pozorovanému v dlouhodobých studiích. Účastníky budou muži, věkově odpovídající (>55 let), nekuřáci, sedavý způsob života a nevegetariáni. Před účastí ve studii všechny subjekty podstoupí lékařské vyšetření a vyplní všeobecný zdravotní dotazník. To bude zahrnovat měření krevního tlaku, srdeční frekvence, 12svodový elektrokardiogram (EKG), biochemii krve a profil krevní srážlivosti. U nekontrolních subjektů bude zařazení do studie určeno měřením obvodu pasu (>100 cm) a zánětlivého stavu (neobézní subjekty s plazmatickými hladinami C-reaktivních proteinů (CRP) <1,35 μg.ml-1 a plazmatické hladiny tumor nekrotizujícího faktoru alfa (TNFα) <3,3 pg.ml-1 a ​​obézních jedinců s CRP >1,35 μg.ml-1 a ​​TNFα >4,1 pg.ml-1). Po vysvětlení studie a souvisejících postupů bude získán písemný souhlas a subjekty budou informovány, že mohou kdykoli odstoupit. Subjekty budou získávány prostřednictvím inzerátů v tisku od místního obyvatelstva.

Experimentální zkoušky:

Na začátku 12týdenní studie bude u všech subjektů stanovena syntéza svalových proteinů a odbourávání proteinů nohou podáváním stabilních izotopů leucinu a fenylalaninu souběžně s dvoufázovým inzulínovým svorníkem pro simulaci přechodu z lačno do napájený stát. Tím se stanoví základní hodnoty pro tato opatření před 12týdenním obdobím intervence. Tato opatření budou dosažena během jediné návštěvy s provedením zavedeného protokolu pro stanovení syntézy svalových bílkovin a odbourávání bílkovin nohou. Stručně řečeno, za účelem dosažení tohoto bude provedeno následující: bude získána biopsie bazálního svalu ze stehna, po které budou koncentrace inzulínu v séru udržovány na hladinách nalačno a bude získána další svalová biopsie; po užití budou koncentrace inzulínu v séru zvýšeny a budou podávány smíšené aminokyseliny pro simulaci krmení, po čemž bude následovat třetí a poslední svalová biopsie. Odebírání biopsií umožní stanovení inkorporace izotopů a tím stanovení syntézy svalových bílkovin a rychlosti odbourávání bílkovin nohou.

Po první experimentální návštěvě zahájí subjekty 12týdenní období léčby buď pioglitazonem (30 mg•den-1) nebo placebem, podávaným dvojitě zaslepeným způsobem. Subjekty budou monitorovány v intervalech po celé období, aby se zajistilo dodržování a hlásily nežádoucí vedlejší účinky. Po 12 týdnech podávání léku nebo placeba se subjekty vrátí do laboratoře k opakování měření stanovených při první experimentální návštěvě (syntéza svalových proteinů a odbourávání proteinů nohou v reakci na simulované krmení). Cirkulující hladiny vybraných cytokinů budou navíc vyšetřeny ve vzorcích krve odebraných subjektům na začátku dvou experimentálních návštěv (před a po 12týdenním období lékové intervence), což umožní posouzení jakýchkoli souvisejících změn mezi systémovými koncentracemi cytokinů a syntéza svalových bílkovin a odbourávání bílkovin nohou.

Protokol studie:

Studie zahrnuje dvě návštěvy oddělené 12týdenním obdobím drogové intervence. Při každé ze dvou návštěv je třeba hodnotit syntézu svalových bílkovin a rychlost odbourávání bílkovin nohou v reakci na simulované krmení pomocí zavedeného experimentálního protokolu popsaného níže:

Subjekty budou požádány, aby se zdržely alkoholu a cvičení po dobu 48 hodin před každou experimentální návštěvou a aby se dostavily ráno v den experimentální návštěvy nalačno. Subjekty budou požádány, aby odpočívaly v pololeže na zádech, zatímco je kanyla zavedena retrográdně do povrchové žíly na dorzálním povrchu nedominantní ruky pro odběr krve. Ruka bude udržována v zahřívací jednotce (teplota vzduchu 50-55°C), aby se arterializoval venózní drenáž ruky. Do antekubitální žíly na každém předloktí bude umístěna kanyla pro infuzi inzulínu, oktreotidu, glukózy, aminokyselin a infuze stabilních izotopů leucinu a fenylalaninu, aby se přesně simulovalo krmení; katétr umístěný do stehenní žíly umožní ve spojení se vzorky arterializované žilní (A-V) krve odběr arteriální a venózní krve přes nohu. Aby se vyhodnotila syntéza svalových bílkovin a rychlost odbourávání bílkovin v nohou v reakci na krmení, bude sérový inzulín zpočátku udržován na koncentracích nalačno podáváním inzulínu (0,6 mU•m-2•min-1) po dobu 120 minut, aby se zabránilo endogennímu inzulínu produkce, oktreotid (30 ng•kg-1•min-1). Poté, aby se simulovalo krmení, koncentrace inzulinu v séru se zvýší ekvivalentně ke stavu nasycení po dobu 120 minut (~40 mU•l-1) a 20 g smíšených aminokyselin (Glamin® Fresenius-Kabi, UK) podaných infuzí ve spojení s glukózy ke stabilizaci koncentrací glukózy v krvi (~4,5 mmol.l-1). Během experimentální návštěvy budou udržovány infuze stabilních izotopových verzí fenylalaninu a leucinu. Zpočátku bude podána jedna základní dávka [2H5]fenylalaninu (0,33 mg•kg-1 tělesné hmotnosti, 98 atom% přebytek) a [1-13C]leucinu (0,8 mg•kg-1 tělesné hmotnosti, 99% přebytek atomu). podána, následovaná konstantní infuzí 0,5 mg•kg-1•h-1 fenylalaninu a 1,0 mg•kg-1•h-1 leucinu. Použití těchto dvou stabilních izotopů v kombinaci se svalovými biopsiemi získanými z m. vastus lateralis nohy v čase t = 0, 120 a 240 minut a odběrem krve během návštěvy umožní syntézu svalových bílkovin a rychlost odbourávání bílkovin nohou v reakci na krmení, které se má vypočítat. V pravidelných intervalech během experimentálního období bude monitorována výměna dýchacích plynů měřením spotřeby kyslíku (O2) a produkce oxidu uhličitého (CO2) pomocí nepřímého kalorimetru s ventilovanou digestoří (NutrEn, UK) pro výpočet poměru výměny dýchacích cest.

Po dokončení úvodní návštěvy, kde byla stanovena základní měření syntézy svalových bílkovin a odbourávání bílkovin nohou v reakci na krmení, začne 12týdenní období lékové intervence. Po dokončení 12týdenní intervence se výše popsaná studijní návštěva zopakuje, aby se určily účinky intervence na uvedená výsledná opatření.

Kolekce vzorků:

Na začátku každé experimentální návštěvy bude odebráno 8 ml krve z venózní kanyly do vakuových nádob s kyselinou ethylendiamintetraoctovou (EDTA). Po centrifugaci při 4 °C bude extrahovaná plazma skladována při -80 °C, aby bylo možné později stanovit cirkulující hladiny vybraných cytokinů. Během inzulínové svorky bude každých 5 minut odebrán 1 ml A-V krve pro monitorování koncentrace glukózy v krvi (YSI 2300 STATplus, Yellow Springs Instruments, USA). A-V krev (5 ml) se odebere na začátku a v +30, +75, +90, +105, +120, +150, +195, +210, +225, +240 min, nechá se srazit, odstředí, a sérum uložené v kapalném dusíku. Inzulin bude v těchto vzorcích měřen později pomocí soupravy pro radioimunoanalýzu (Coat-a-Count Insulin, USA). Vzorky femorální žilní a A-V krve (2 ml) budou odebrány pro měření krevního indikátoru při -5, +75, +90, +105, +120, +195, +210, +225, +240 min, centrifugováno při 4° C a skladovány při -80 °C. Svalové biopsie budou získány z m. vastus lateralis v 0, +120 a +240 min za použití techniky perkutánní biopsie jehlou. Vzorky svalů budou před stanovením inkorporace [1-13C]leucinu bleskově zmrazeny v kapalném dusíku.

Následná péče o předměty:

Audit minulých studií zkoušejícího zahrnujících svalové biopsie a kanylační procedury ukázal, že tyto procedury jsou subjekty dobře tolerovány a mají málo významných komplikací. Zjizvení kůže je minimální a po několika měsících neviditelné. Všechny svalové biopsie jsou získávány za sterilních podmínek lékařsky kvalifikovaným personálem a po injekci lokálního anestetika. Všechny subjekty jsou pečlivě sledovány před, během a po proceduře, aby bylo zajištěno, že se po celou dobu cítí pohodlně. Po každé biopsii se kůže uzavře sterilním lepicím proužkem a překryje voděodolným lepicím obvazem. Po odstranění kanyly se aplikuje tlak, aby se zastavilo krvácení, a místa se překryjí voděodolným adhezivním obvazem. Subjekty dostanou před odchodem z laboratoře leták obsahující informace o následné péči a kontaktní údaje našich lékařů, pokud by potřebovali poradit. Dále budou subjekty telefonicky kontaktovány v týdnech 2, 6 a 10, aby se potvrdila nepřítomnost jakýchkoli nežádoucích účinků podávání léku. Subjektům budou také poskytnuty kontaktní údaje, které mohou použít v případě jakýchkoliv obav.

Měření a analýzy:

Vzorky svalové biopsie a vzorky krve se měří na začlenění indikátoru, což umožňuje vypočítat rychlost syntézy svalových bílkovin a jejich rozpadu. Odebrané vzorky krve budou analyzovány na cirkulující hladiny cytokinů. Provedením těchto měření před a po léčbě pioglitazonem budou stanoveny důsledky zánětu u starších jedinců na svalový metabolismus. Statistická analýza se provede pomocí analýzy rozptylu (ANOVA).