Az elhízásból származó citokinek hatása a fehérjeforgalomra és a szénhidrát-anyagcserére az emberi vázizomzatban

Tantárgyak toborzása:

24 elhízott (de egyébként egészséges) résztvevőt vesznek fel, akiknek emelkedett citokinszintjük van, és 24 nem elhízott, normál citokinszinttel rendelkező alanyt. Az első kísérleti látogatást követően (lásd alább) a résztvevőket kettős vak módszerrel négy csoportra osztják (n=12). Korábbi, hasonló, alacsony fokú gyulladásos állapotokat alkalmazó vizsgálatokban, ahol tiazolidindionokat alkalmaztak, szignifikáns különbségeket (P<0,05) figyeltek meg a vizsgált folyamatokban 10 fős csoportlétszám esetén. Ezért a 12 fős csoportokat úgy választották ki, hogy alkalmazkodjanak a hosszú távú vizsgálatok során tapasztalt 15%-os lemorzsolódáshoz. A résztvevők férfiak, azonos korúak (>55 év), nem dohányzók, mozgásszegény életmódot folytatnak és nem vegetáriánusok. A vizsgálatban való részvétel előtt minden alany orvosi szűrésen esik át, és kitölt egy általános egészségügyi kérdőívet. Ez magában foglalja a vérnyomás, a pulzusszám, a 12 elvezetéses elektrokardiogram (EKG), a vér biokémiáját és a véralvadási profil mérését. A nem kontroll alanyok esetében a vizsgálatba való bevonást a derékbőség (>100 cm) és a gyulladásos állapot (nem elhízott alanyok, akiknél a C-reaktív proteinek (CRP) plazmaszintje <1,35 μg.ml-1 és tumor nekrózis faktor-alfa (TNFα) plazmaszintje <3,3 pg.ml-1 és elhízott alanyok, akiknél a CRP >1,35 μg.ml-1 és a TNFα >4,1 pg.ml-1). A vizsgálat és a kapcsolódó eljárások magyarázatát követően írásos beleegyezést kell beszerezni, és az alanyokat tájékoztatni kell arról, hogy bármikor visszaléphetnek. Az alanyokat a helyi lakosság sajtóhirdetéseivel toborozzák.

Kísérleti próbák:

Egy 12 hetes vizsgálat kezdetén minden alanyban meghatározzák az izomfehérje szintézist és a lábfehérje lebomlását a leucin és a fenilalanin stabil izotópjainak egyidejű beadásával egy kétlépcsős inzulinkapoccsal, hogy szimulálják az éhgyomorra való átállást. táplált állam. Ez meghatározza ezen intézkedések alapértékeit a 12 hetes beavatkozási időszak előtt. Ezeket az intézkedéseket egyetlen vizittel érik el, az izomfehérje szintézis és a lábfehérje lebontás meghatározására szolgáló protokoll végrehajtásával. Összefoglalva, ennek eléréséhez a következőket kell végrehajtani: alapizom-biopsziát veszünk a combból, amely után a szérum inzulinkoncentrációit éhgyomri szinten tartják, és további izombiopsziát veszünk; a bevételt követően a szérum inzulinkoncentrációja megemelkedik, és kevert aminosavakat adagolnak az etetés szimulálására, majd egy harmadik és egy utolsó izombiopsziát vesznek. A biopsziák vétele lehetővé teszi az izotóp beépülésének meghatározását, és ezáltal az izomfehérje szintézis és a lábfehérje lebontási sebességének meghatározását.

Az első kísérleti látogatást követően az alanyok 12 hetes pioglitazon (30 mg•nap-1) vagy placebo kezelést kezdenek, kettős vak módszerrel. Az alanyokat az időszak során rendszeres időközönként ellenőrizni fogják, hogy biztosítsák a megfelelést, és jelentsék a nem kívánt mellékhatásokat. 12 hét gyógyszer- vagy placebo-adás után az alanyok visszatérnek a laboratóriumba, hogy megismételjék az első kísérleti látogatás során meghatározott méréseket (izomfehérje szintézis és lábfehérje lebomlás a szimulált táplálásra válaszul). A kiválasztott citokinek keringésben lévő szintjét a két kísérleti látogatás kezdetén (a 12 hetes gyógyszeres beavatkozás előtti és utáni időszak) az alanyoktól gyűjtött vérmintákban is megvizsgálják, így lehetővé válik a szisztémás citokinkoncentrációk és a citokinkoncentrációk közötti esetleges kapcsolódó változások értékelése. izomfehérje szintézis és lábfehérje lebontás.

Vizsgálati protokoll:

A vizsgálat két látogatásból áll, amelyeket 12 hetes gyógyszeres beavatkozási időszak választ el. Mindkét látogatás alkalmával fel kell mérni az izomfehérje szintézisét és a lábfehérje lebomlását a szimulált táplálásra adott válaszként az alább leírt kísérleti protokoll segítségével:

Az alanyokat arra kérik, hogy minden kísérleti látogatás előtt 48 órával tartózkodjanak az alkoholfogyasztástól és a testmozgástól, és a kísérleti látogatás reggelén éhgyomorra érkezzenek. Az alanyokat arra kérik, hogy félig hanyatt fekve pihenjenek, miközben egy kanült retrográd módon helyeznek be a nem domináns kéz háti felszínén lévő felületes vénába vérvétel céljából. A kezet kézmelegítő egységben tartják (levegő hőmérséklet 50-55°C), hogy arterializálják a kéz vénás elvezetését. Mindegyik alkarban egy antecubitalis vénába kanült helyeznek az inzulin, oktreotid, glükóz, aminosavak és leucin és fenilalanin stabil izotóp infúziójának infúziójához a táplálás pontos szimulálásához; a femoralis vénába helyezett katéter az arterializált vénás (A-V) vérmintákkal együtt lehetővé teszi az artériás és vénás vérmintavételt a lábon keresztül. Az izomfehérje-szintézis és a lábfehérje-lebomlás mértékének felmérése a táplálkozás hatására a szérum inzulint kezdetben éhgyomri koncentrációban kell tartani inzulin (0,6 mU•m-2•min-1) adagolásával 120 percig, és az endogén inzulin kialakulásának megakadályozása érdekében. termelés, oktreotid (30 ng•kg-1•min-1). Ezután az etetés szimulálásához a szérum inzulinkoncentrációt a táplált állapotnak megfelelő mértékben növelik 120 percig (~40 mU•l-1), és 20 g vegyes aminosavat (Glamin® Fresenius-Kabi, Egyesült Királyság) adnak be infúzióval együtt glükózt a vércukorkoncentráció stabilizálására (~4,5 mmol.l-1). A fenilalanin és a leucin stabil izotóp változatainak infúzióját a kísérleti látogatás során fenntartják. Kezdetben a [2H5]fenilalanin (0,33 mg•kg-1 testtömeg, 98 atom%-os felesleg) és a [1-13C]leucin (0,8 mg•kg-1 testtömeg, 99 atom%-os felesleg) egyszeri bevezető adagja lesz. beadása, majd 0,5 mg•kg-1•h-1 fenilalanin és 1,0 mg•kg-1•h-1 leucin állandó infúziója. Ennek a két stabil izotópnak a használata a láb vastus lateralis izomzatából t = 0, 120 és 240 percnél vett izombiopsziával, valamint a vizit alatti vérmintával kombinálva lehetővé teszi az izomfehérje szintézisét és a lábfehérje lebomlását válaszként. a takarmányozáshoz számolni kell. A kísérleti időszak során rendszeres időközönként a légúti gázcserét az oxigén (O2) felvétel és a szén-dioxid (CO2) termelés mérésével, szellőztetett kámzsa indirekt kaloriméterrel (NutrEn, Egyesült Királyság) figyelemmel kísérik a légzéscsere arányának kiszámításához.

A kezdeti vizit befejezése után, ahol az izomfehérje szintézis és a lábfehérje lebomlásának alapértékeit meghatározták az etetés hatására, megkezdődik a 12 hetes gyógyszeres beavatkozási időszak. A 12 hetes beavatkozás befejeztével a fent leírt tanulmányi látogatást meg kell ismételni, hogy meghatározzák a beavatkozásnak a felsorolt ​​kimeneti intézkedésekre gyakorolt ​​hatását.

Minta kollekció:

Minden kísérleti látogatás kezdetén 8 ml vért vesznek egy vénás kanülből etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA) vakutainersbe. A 4 °C-on végzett centrifugálást követően az extrahált plazmát -80 °C-on tárolják, hogy lehetővé tegyék a kiválasztott citokinek keringő szintjének későbbi meghatározását. Az inzulinbilincs alatt 5 percenként 1 ml A-V vért vesznek a vércukorkoncentráció monitorozására (YSI 2300 STATplus, Yellow Springs Instruments, USA). Az A-V vért (5 ml) az alapvonalon és +30, +75, +90, +105, +120, +150, +195, +210, +225, +240 percen belül gyűjtik, hagyják megalvadni, centrifugálják, és a folyékony nitrogénben tárolt szérum. Ezekben a mintákban az inzulint egy későbbi időpontban egy radioimmunoassay kit (Coat-a-Count Insulin, USA) segítségével mérik. Femorális vénás és A-V vérmintákat (2 ml) vesznek a vérnyomkövető mérésekhez -5, +75, +90, +105, +120, +195, +210, +225, +240 percen, centrifugálva 4°-on. C-on és -80 °C-on tároljuk. Izombiopsziát vesznek a vastus lateralis izomból 0, +120 és +240 percnél percutan tűs biopsziás technikával. Az [1-13C]leucin beépülésének meghatározása előtt az izommintákat folyékony nitrogénben pillanatok alatt lefagyasztják.

Az alanyok utógondozása:

A nyomozó korábbi, izombiopsziával és kanülozási eljárásokkal végzett vizsgálatainak auditálása azt mutatta, hogy az eljárásokat az alanyok jól tolerálják, és kevés jelentős szövődményük van. A bőr hegesedése minimális és néhány hónap után láthatatlan. Az összes izombiopsziát steril körülmények között, orvosi képesítéssel rendelkező személyzet veszi, helyi érzéstelenítő injekció beadása után. Minden alanyt gondosan megfigyelnek az eljárás előtt, közben és után, hogy mindig kényelmesen érezzék magukat. Minden biopszia után a bőrt steril ragasztócsíkkal lezárjuk, és vízálló ragasztó kötéssel fedjük le. A kanülök eltávolításakor nyomást gyakorolnak a vérzés megállítására, és a helyeket vízálló öntapadó kötéssel kötik be. Az alanyok a laboratórium elhagyása előtt kapnak egy tájékoztatót, amely tartalmazza az utógondozási információkat és a klinikusaink elérhetőségeit, ha tanácsra van szükségük. Továbbá az alanyokkal telefonon is felvesszük a kapcsolatot a 2., 6. és 10. héten, hogy megbizonyosodjunk arról, hogy a gyógyszer beadása nem okoz semmilyen káros hatást. Az alanyok elérhetőségeiket is megkapják, amelyeket használhatnak, ha aggályaik vannak.

Mérések és elemzések:

Az izombiopsziás mintákat és a vérmintákat meg kell mérni a nyomjelző beépülése szempontjából, lehetővé téve az izomfehérje szintézisének és lebomlásának sebességének kiszámítását. Az összegyűjtött vérmintákat elemzik a keringő citokinek szintjére. A pioglitazon kezelés előtti és utáni mérések elvégzésével megállapítható, hogy idős egyének gyulladása milyen hatással van az izomanyagcserére. A statisztikai elemzést varianciaanalízissel (ANOVA) kell elvégezni.