Wpływ cytokin pochodzących z otyłości na obrót białkami i metabolizm węglowodanów w mięśniach szkieletowych człowieka

Rekrutacja przedmiotów:

Zrekrutowanych zostanie 24 otyłych (ale poza tym zdrowych) uczestników z podwyższonym poziomem cytokin i 24 nieotyłych osobników z prawidłowym poziomem cytokin. Po pierwszej wizycie eksperymentalnej (patrz poniżej) uczestnicy zostaną podzieleni metodą podwójnie ślepej próby na cztery grupy (n=12). We wcześniejszych badaniach wykorzystujących podobne stany zapalne niskiego stopnia, w których podawano tiazolidynodiony, zaobserwowano znaczące różnice (P <0,05) w badanych procesach przy wielkości grup 10. Dlatego wybrano 12-osobowe grupy, aby uwzględnić przewidywany 15% spadek obserwowany w badaniach długoterminowych. Uczestnikami będą mężczyźni w odpowiednim wieku (>55 lat), niepalący, prowadzący siedzący tryb życia i nie będący wegetarianami. Przed wzięciem udziału w badaniu wszyscy uczestnicy przejdą badania lekarskie i wypełnią ankietę dotyczącą ogólnego stanu zdrowia. Obejmuje to pomiary ciśnienia krwi, tętna, 12-odprowadzeniowego elektrokardiogramu (EKG), biochemii krwi i profilu krzepnięcia krwi. W przypadku osób niebędących grupą kontrolną włączenie do badania zostanie określone na podstawie pomiarów obwodu talii (>100 cm) i stanu zapalnego (osoby nieotyłe z poziomem białek C-reaktywnych (CRP) w osoczu <1,35 μg.ml-1 i poziom czynnika martwicy nowotworu-alfa (TNFα) w osoczu <3,3 pg.ml-1 oraz osoby otyłe z CRP >1,35 μg.ml-1 i TNFα >4,1 pg.ml-1). Po wyjaśnieniu badania i związanych z nim procedur uzyskana zostanie pisemna zgoda, a uczestnicy zostaną poinformowani, że mogą wycofać się w dowolnym momencie. Osoby badane będą rekrutowane za pośrednictwem ogłoszeń prasowych pochodzących od miejscowej ludności.

Próby eksperymentalne:

Na początku 12-tygodniowego badania u wszystkich badanych zostanie określona synteza białek mięśniowych i rozpad białek nóg poprzez podanie stabilnych izotopów leucyny i fenyloalaniny w połączeniu z dwuetapowym zaciskiem insulinowym, aby zasymulować przejście od głodówki do stan nakarmiony. Pozwoli to ustalić wartości bazowe dla tych środków przed 12-tygodniowym okresem interwencji. Środki te zostaną osiągnięte podczas jednej wizyty z wykonaniem ustalonego protokołu oznaczania syntezy białek mięśniowych i rozpadu białek nóg. Podsumowując, aby to osiągnąć, zostaną wykonane następujące czynności: zostanie pobrana biopsja mięśnia podstawnego uda, po której stężenie insuliny w surowicy zostanie utrzymane na poziomie na czczo, a następnie uzyskana zostanie kolejna biopsja mięśnia; po pobraniu stężenie insuliny w surowicy będzie podwyższone, a mieszanka aminokwasów zostanie podana w celu symulacji karmienia, po czym nastąpi pobranie trzeciej i ostatniej biopsji mięśnia. Pobranie biopsji pozwoli na określenie wbudowywania izotopów, a tym samym określenie syntezy białek mięśniowych i szybkości rozpadu białek nóg.

Po pierwszej wizycie eksperymentalnej osoby badane rozpoczną 12-tygodniowy okres leczenia pioglitazonem (30 mg•dzień-1) lub placebo, podawanymi metodą podwójnie ślepej próby. Pacjenci będą monitorowani w odstępach czasu przez cały okres, aby zapewnić przestrzeganie zaleceń i zgłaszać niepożądane skutki uboczne. Po 12 tygodniach podawania leku lub placebo badani wrócą do laboratorium na powtórzenie pomiarów określonych podczas pierwszej wizyty eksperymentalnej (synteza białek mięśniowych i rozpad białek nóg w odpowiedzi na symulowane karmienie). Poziomy wybranych cytokin w krwiobiegu zostaną dodatkowo zbadane w próbkach krwi pobranych od osób na początku dwóch wizyt doświadczalnych (przed i po 12-tygodniowym okresie interwencji lekowej), co pozwoli na ocenę wszelkich powiązanych zmian między ogólnoustrojowymi stężeniami cytokin a syntezę białek mięśniowych i rozpad białek nóg.

Protokół badania:

Badanie obejmuje dwie wizyty oddzielone 12-tygodniowym okresem interwencji lekowej. Podczas każdej z dwóch wizyt ocenia się syntezę białek mięśniowych i wskaźniki rozpadu białek nóg w odpowiedzi na symulowane karmienie, stosując ustalony protokół eksperymentalny opisany poniżej:

Osoby badane zostaną poproszone o powstrzymanie się od alkoholu i ćwiczeń przez 48 godzin przed każdą wizytą eksperymentalną i przybycie na czczo rano w dniu wizyty eksperymentalnej. Pacjenci zostaną poproszeni o odpoczynek w pozycji półleżącej, podczas gdy kaniula zostanie wprowadzona wstecznie do żyły powierzchownej na grzbietowej powierzchni ręki niedominującej w celu pobrania krwi. Dłoń będzie trzymana w urządzeniu do ogrzewania dłoni (temperatura powietrza 50-55°C) w celu arterializacji drenażu żylnego dłoni. Kaniula zostanie umieszczona w żyle przedłokciowej w każdym przedramieniu w celu wlewu insuliny, oktreotydu, glukozy, aminokwasów i infuzji stabilnych izotopów leucyny i fenyloalaniny w celu symulacji karmienia w precyzyjny sposób; cewnik umieszczony w żyle udowej umożliwi, w połączeniu z próbkami krwi z tętnicy żylnej (A-V), pobranie krwi tętniczej i żylnej z całej nogi. Aby ocenić syntezę białek mięśniowych i szybkość rozpadu białek nóg w odpowiedzi na karmienie, stężenie insuliny w surowicy będzie początkowo utrzymywane na czczo przez podawanie insuliny (0,6 mU•m-2•min-1) przez 120 minut oraz, aby zapobiec endogennej insulinie produkcja oktreotydu (30 ng•kg-1•min-1). Następnie, aby zasymulować karmienie, stężenie insuliny w surowicy zostanie zwiększone równoważnie do stanu po posiłku przez 120 minut (~40 mU•l-1) i 20 g mieszanki aminokwasów (Glamin® Fresenius-Kabi, Wielka Brytania) podane we wlewie w połączeniu z glukoza do stabilizacji stężenia glukozy we krwi (~4,5 mmol.l-1). Wlewy stabilnych wersji izotopowych fenyloalaniny i leucyny będą utrzymywane przez całą wizytę eksperymentalną. Początkowo podaje się pojedynczą dawkę pierwotną [2H5]fenyloalaniny (0,33 mg•kg-1 masy ciała, nadmiar 98% atomów) i [1-13C]leucyny (0,8 mg•kg-1 masy ciała, nadmiar 99% atomów) a następnie ciągły wlew 0,5 mg•kg-1•h-1 fenyloalaniny i 1,0 mg•kg-1•h-1 leucyny. Zastosowanie tych dwóch stabilnych izotopów w połączeniu z biopsjami mięśnia obszernego bocznego nogi w t = 0, 120 i 240 min oraz pobieranie krwi podczas wizyty pozwoli na syntezę białek mięśniowych i szybkość rozpadu białek nóg w odpowiedzi do karmienia do obliczenia. W regularnych odstępach czasu przez cały okres eksperymentu wymiana gazów oddechowych będzie monitorowana poprzez pomiar poboru tlenu (O2) i produkcji dwutlenku węgla (CO2) za pomocą pośredniego kalorymetru z wentylowanym kapturem (NutrEn, Wielka Brytania) w celu obliczenia współczynnika wymiany oddechowej.

Po zakończeniu wizyty wstępnej, podczas której ustalono podstawowe pomiary syntezy białek mięśniowych i rozpadu białek nóg w odpowiedzi na karmienie, rozpocznie się 12-tygodniowy okres interwencji lekowej. Po zakończeniu 12-tygodniowej interwencji, wizyta studyjna opisana powyżej zostanie powtórzona w celu określenia wpływu interwencji na wymienione wskaźniki wyników.

Kolekcja próbek:

Na początku każdej wizyty doświadczalnej, 8 ml krwi zostanie pobrane z kaniuli żylnej do pojemników z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA). Po odwirowaniu w temperaturze 4°C wyekstrahowane osocze będzie przechowywane w temperaturze -80°C, aby umożliwić późniejsze określenie poziomów wybranych cytokin w krwioobiegu. Podczas klamry insulinowej co 5 minut będzie pobierany 1 ml krwi A-V w celu monitorowania stężenia glukozy we krwi (YSI 2300 STATplus, Yellow Springs Instruments, USA). Krew A-V (5 ml) zostanie pobrana na początku badania i przy +30, +75, +90, +105, +120, +150, +195, +210, +225, +240 min, pozostawiona do skrzepnięcia, odwirowana, i surowica przechowywana w ciekłym azocie. Insulina zostanie zmierzona w tych próbkach w późniejszym terminie za pomocą zestawu do testu radioimmunologicznego (Coat-a-Count Insulin, USA). Próbki krwi żylnej udowej i krwi AV (2 ml) zostaną pobrane do pomiarów śladowych krwi w -5, +75, +90, +105, +120, +195, +210, +225, +240 min, odwirowane w 4° C i przechowywano w temperaturze -80°C. Biopsje mięśni będą pobierane z mięśnia obszernego bocznego w 0, +120 i +240 min, przy użyciu techniki przezskórnej biopsji igłowej. Próbki mięśni zostaną szybko zamrożone w ciekłym azocie przed oznaczeniem wbudowywania [1-13C]leucyny.

Opieka nad podopiecznymi:

Audyt wcześniejszych badań badacza obejmujących biopsje mięśni i procedury kaniulacji wykazał, że procedury te są dobrze tolerowane przez pacjentów i powodują niewiele istotnych powikłań. Bliznowacenie skóry jest minimalne i niewidoczne po kilku miesiącach. Wszystkie biopsje mięśni są pobierane w sterylnych warunkach przez wykwalifikowany personel medyczny i po podaniu środka miejscowo znieczulającego. Wszystkie osoby są dokładnie monitorowane przed, w trakcie i po zabiegu, aby zapewnić im komfort przez cały czas. Po każdej biopsji skóra jest zamykana sterylnym plastrem i przyklejana wodoodpornym opatrunkiem. Po wyjęciu kaniuli stosuje się ucisk w celu zatamowania krwawienia, a miejsca opatruje się wodoodpornym opatrunkiem samoprzylepnym. Przed opuszczeniem laboratorium badani otrzymują ulotkę zawierającą informacje dotyczące opieki pooperacyjnej oraz dane kontaktowe naszych klinicystów, gdyby potrzebowali porady. Ponadto z osobnikami skontaktuje się telefonicznie w tygodniach 2, 6 i 10 w celu potwierdzenia braku jakichkolwiek niepożądanych skutków podawania leku. Osoby badane otrzymają również dane kontaktowe, z których mogą skorzystać w razie jakichkolwiek wątpliwości.

Pomiary i analiza:

Próbki z biopsji mięśni i próbki krwi są mierzone pod kątem włączenia znacznika, co umożliwia obliczenie tempa syntezy i rozpadu białek mięśniowych. Pobrane próbki krwi zostaną przeanalizowane pod kątem poziomu krążących cytokin. Wykonując te pomiary przed i po leczeniu pioglitazonem, zostanie określony wpływ stanu zapalnego u osób w podeszłym wieku na metabolizm mięśni. Analizę statystyczną przeprowadza się z wykorzystaniem analizy wariancji (ANOVA).