Dépistage des gènes candidats pour le trouble déficitaire de l'attention/hyperactivité (TDAH)

Source : banque d'échantillons de l'hôpital Xijing et de l'hôpital pour enfants affilié à l'université de Soochow ; Forme d'échantillon : sang total ; Estimation du nombre d'échantillons : 100 patients atteints de TDAH et témoins sains appariés selon l'âge et le sexe ; Critères d'exclusion des cas : toutes sortes de troubles neuropsychiatriques, valeur de QI inférieure à 70 ;

Protocole d'étude:

1. Utilisation du kit Qiagen pour extraire l'ADN génomique de 200 microlitres de sang. (1) faire fondre le sang congelé à température ambiante ; (2) prendre le sang de 0,2 ml dans un tube à centrifuger stérile anti coagulation, ajouter un volume égal de tampon phosphate PBS, après avoir complètement mélangé 12000rpm centrifugation 5min, jeter le surnageant ; (3) 66,7 L STE 2,4 L, 20 % SDS, 37 DEG C bain-marie 1 h ; (4) protéase K plus 1 mélange de 20 mg/ml, digestion au bain-marie à 55 degrés C pendant la nuit (10 à 14 h ); (5) les échantillons digérés traités avec du phénol saturé de Tris, bien agiter, centrifuger à 12 000 tr/min pendant 10 min ; (6) la phase aqueuse supérieure dans un tube à centrifuger stérile ; ajouter un volume de phénol saturé de Tris, bien agiter, centrifuger à 12 000 tr/min pendant 10 min ; (7) la phase aqueuse supérieure a été transférée dans un autre tube à centrifuger stérile, et un volume égal de phénol a été ajouté : chloroforme : alcool isoamylique (25 : 24 : 1). L'oscillation du vortex a été complètement mélangée, et le 12000rpm a été centrifugé à 10min ; (8) la phase aqueuse supérieure a été transférée dans un autre tube à centrifuger stérile et un volume égal de chloroforme a été ajouté : alcool isoamylique (24 : 1), qui a été entièrement vibré et mélangé avec une centrifugation à 12 000 t/min pendant 10 minutes ; (9) transférer le surnageant dans un autre tube à centrifuger stérile ; ajouter 2 fois le volume d'éthanol, le niveau du volume d'acétate de sodium 1/10 secouer, jusqu'à ce que la précipitation floculante de l'ADN soit visible ; (10) l'échantillon est placé à -20 DEG C réfrigérateur congélateur 30min ou bain de glace pendant 15 ~ 20min, après retrait de 12000rpm centrifuge 10min à nouveau, de sorte que la précipitation de l'ADN ; (11) la tête du pistolet prélèvera l'ADN dans un autre tube centrifuge stérile, avec la quantité d'éthanol à 70 % de lavage et d'agitation, pour éliminer les impuretés de l'ADN ; (12) hors éthanol, ADN par séchage sous vide ou séchage naturel, tampon TE additionné de dissolution, -20 stocké en veille.
2. Le spectrophotomètre UV teste la pureté de l'ADN de 260/280 proche de 1,8 (1,8 ± 0,05), la concentration de 100ng/μL ou plus avant le prochain séquençage.
3. L'ADN génomique extrait sera envoyé à Sangon Biology Engineering Limited Company (Shanghai) et séquencé pour trouver des mutations candidates liées à la séquence de risque du TDAH. Selon la base de données des gènes du NIH, le plus long transcrit de NDRG2 (ID : gène 57447, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000014.9? Report=genbank&from=21016763&to=21070872&strand=true) (un total de 17 exons et 16 introns et la région 5' UTR et 3' UTR du gène) seront alignées pour trouver des mutations potentielles.
4. Utilisation de l'analyse du chi carré et d'autres méthodes statistiques pour déterminer la relation entre les mutations et la susceptibilité au TDAH.