A figyelemhiány/hiperaktív zavar (ADHD) jelölt génszűrése

Forrás: a Soochow Egyetemhez kapcsolódó Xijing Kórház és Gyermekkórház mintabankja; Mintaforma: Teljes vér; A minták becsült száma: 100 ADHD-s és életkorú beteg, egészséges kontrollok neme; Esetkizárási kritériumok: mindenféle neuropszichiátriai rendellenesség, IQ-érték 70-nél kisebb;

Vizsgálati protokoll:

1. Qiagen készlet használata 200 mikroliter vér genomiális DNS-ének kinyerésére. (1) megolvasztja a fagyasztott vért szobahőmérsékleten; (2) vegyen be 0,2 ml vért egy steril antikoagulációs centrifugacsőbe, adjon hozzá azonos térfogatú PBS-foszfát puffert, 12000 ford./perc centrifugálás 5 perces teljes elkeverése után, dobja ki a felülúszót; (3) 66,7 l STE 2,4 l, 20% SDS, 37 °C-os vízfürdő 1 óra; (4) proteáz K plusz 1 20 mg/ml l keverék, 55 °C-os vízfürdős emésztés egy éjszakán át (10-14 óra); (5) az emésztett mintákat Tris-tel telített fenollal kezeljük, alaposan rázzuk össze, 12000 ford./perc centrifugál 10 perc; (6) a felső vizes fázist egy steril centrifugacsőbe; Tris telített fenol térfogatának hozzáadása, jól összerázzuk, 12000 ford./perc centrifugál 10 perc; (7) a felső vizes fázist átvisszük egy másik steril centrifugacsőbe, és azonos térfogatú fenolt adunk hozzá: kloroform:izoamil-alkohol (25:24:1). Az örvény oszcillációját teljesen összekevertük, és az 12000 fordulat/perc fordulatszámot 10 percre centrifugáltuk; (8) a felső vizes fázist átvittük egy másik steril centrifugacsőbe, és azonos térfogatú kloroformot adtunk hozzá: izoamil-alkoholt (24:1), amelyet teljesen vibráltunk, és 10 percig 12 000 fordulat/perc centrifugálással kevertük; (9) helyezzük át a felülúszót egy másik steril centrifugacsőbe; 2-szeres térfogatú etanol hozzáadásával 1/10 térfogatarányú nátrium-acetátot rázunk, amíg a DNS flokkuláló kicsapódása láthatóvá válik; (10) a mintát -20 C°-os hűtő-fagyasztóba helyezzük 30 percre vagy jeges fürdőbe 15-20 percre, az 12000 fordulat/perc centrifugális 10 perccel ismételt eltávolítása után, hogy a DNS kicsapódjon; (11) a pisztolyfej egy másik steril centrifugális csőbe veszi a DNS-t, 70%-os etanolos mosással és rázatással, hogy kimossák a DNS-szennyeződéseket; (12) etanolból, DNS vákuumszárítással vagy természetes szárítással, TE puffer hozzáadásával, -20 °C készenléti állapotban tárolva.
2. UV spektrofotométeres teszt DNS-tisztaság 260/280 közel 1,8 (1,8 ± 0,05), a koncentráció 100ng/μL vagy több a következő szekvenálás előtt.
3. A kivont genomiális DNS-t elküldik a Sangon Biology Engineering Limited Company-nak (Sanghaj), és szekvenálják, hogy megtalálják az ADHD kockázati szekvenciájához kapcsolódó jelölt mutációkat. A NIH génadatbázisa szerint az NDRG2 leghosszabb átirata (azonosító: 57447 ​​gén, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000014.9? Report=genbank&from=21016763&to=21070872&strand=true) 17 exonból és 16 intronból, valamint az 5. gén 'UTR és 3' UTR régiója) egymáshoz igazodó szekvenciák lesznek, hogy megtalálják a lehetséges mutációkat.
4. A chi square analízis és más statisztikai módszerek alkalmazása a mutációk és az ADHD-ra való érzékenység közötti kapcsolat meghatározására.