Кандидатный генный скрининг синдрома дефицита внимания/гиперактивности (СДВГ)

Источник: Банк выборок больницы Сицзин и детской больницы, входящей в состав Университета Сучжоу; Форма образца: Цельная кровь; Расчетное количество образцов: 100 пациентов с СДВГ по возрасту и полу соответствовали здоровой контрольной группе; Критерии исключения случая: все виды нервно-психических расстройств, значение IQ менее 70;

Протокол исследования:

1. Использование набора Qiagen для выделения геномной ДНК из 200 мкл крови. (1) растопить замороженную кровь при комнатной температуре; (2) взять 0,2 мл крови в стерильную антикоагулянтную центрифужную пробирку, добавить равный объем фосфатного буфера PBS, после полного перемешивания центрифугировать при 12000 об/мин в течение 5 минут, удалить надосадочную жидкость; (3) 66,7 л STE 2,4 л, 20% SDS, водяная баня 37°C, 1 ч; (4) протеаза К плюс 1 20 мг/мл л смеси, расщепление на водяной бане при 55°С в течение ночи (10~14 ч); (5) переваренные образцы, обработанные трис-насыщенным фенолом, хорошо встряхивают, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 10 мин; (6) верхнюю водную фазу в стерильную центрифужную пробирку; добавление объема трис-насыщенного фенола, хорошо встряхнуть, 12000 об/мин в центрифуге 10 мин; (7) верхнюю водную фазу переносили в другую стерильную центрифужную пробирку и добавляли равный объем фенола: хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1). Колебание вихря было полностью смешано, а 12000 об/мин центрифугированы до 10 мин; (8) верхнюю водную фазу переносили в другую стерильную центрифужную пробирку и добавляли равный объем хлороформа: изоамилового спирта (24:1), который полностью встряхивали и перемешивали центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин; (9) перенести супернатант в другую стерильную центрифужную пробирку; добавление 2-кратного объема этанола, объемный уровень ацетата натрия 1/10 взбалтывать, до появления видимого хлопьевидного осадка ДНК; (10) образец помещают в холодильник с морозильной камерой -20°C на 30 минут или в ледяную баню на 15 ~ 20 минут, после удаления центрифуги со скоростью 12000 об/мин снова на 10 минут, так что происходит осаждение ДНК; (11) головка пистолета выберет ДНК в другую стерильную центрифужную пробирку с количеством 70% этанола, промывая и встряхивая, чтобы вымыть примеси ДНК; (12) из ​​этанола, ДНК с помощью вакуумной сушки или естественной сушки, добавление буфера TE для растворения, -20 хранится в режиме ожидания.
2. УФ-спектрофотометр проверяет чистоту ДНК 260/280, близкую к 1,8 (1,8 ± 0,05), концентрацию 100 нг/мкл или более перед следующим секвенированием.
3. Извлеченная геномная ДНК будет отправлена ​​в Sangon Biology Engineering Limited Company (Шанхай) и секвенирована для поиска мутаций-кандидатов, связанных с последовательностью риска СДВГ. Согласно базе данных генов NIH, самый длинный транскрипт NDRG2 (ID: ген 57447, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000014.9? Report=genbank&from=21016763&to=21070872&strand=true) (всего из 17 экзонов и 16 интронов, а также области 5 'UTR и 3 'UTR гена) будут выровнены последовательности, чтобы найти потенциальные мутации.
4. Использование анализа хи-квадрат и других статистических методов для определения взаимосвязи между мутациями и предрасположенностью к СДВГ.