Kandidaten-Gen-Screening auf Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung (ADHS)

Quelle: Probenbank des Xijing-Krankenhauses und des Kinderkrankenhauses der Soochow-Universität; Probenform: Vollblut; Geschätzte Anzahl der Proben: 100 Patienten mit ADHS und alters- und geschlechtsangepasste gesunde Kontrollpersonen; Fallausschlusskriterien: alle Arten neuropsychiatrischer Erkrankungen, IQ-Wert unter 70;

Studienprotokoll:

1. Verwendung des Qiagen-Kits zur Extraktion der genomischen DNA aus 200 Mikrolitern Blut. (1) gefrorenes Blut bei Raumtemperatur schmelzen; (2) Nehmen Sie 0,2 ml Blut in ein steriles Antikoagulations-Zentrifugenröhrchen, fügen Sie ein gleiches Volumen PBS-Phosphatpuffer hinzu, zentrifugieren Sie nach vollständigem Mischen 5 Minuten lang bei 12.000 U/min und verwerfen Sie den Überstand. (3) 66,7 l STE 2,4 l, 20 % SDS, 37 °C Wasserbad 1 Stunde; (4) Protease K plus 1 20 mg/ml l-Mischung, 55 °C Wasserbadaufschluss über Nacht (10–14 Stunden); (5) Die aufgeschlossenen Proben werden mit Tris-gesättigtem Phenol behandelt, gut geschüttelt, 10 Minuten lang bei 12.000 U/min zentrifugiert; (6) die obere wässrige Phase in ein steriles Zentrifugenröhrchen geben; Volumen von mit Tris gesättigtem Phenol hinzufügen, gut schütteln, 10 Min. bei 12.000 U/min zentrifugieren; (7) Die obere wässrige Phase wurde in ein anderes steriles Zentrifugenröhrchen überführt und ein gleiches Volumen Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24: 1) hinzugefügt. Die Schwingung des Wirbels war vollständig gemischt und die 12.000 U/min wurden auf 10 Minuten zentrifugiert; (8) Die obere wässrige Phase wurde in ein anderes steriles Zentrifugenröhrchen überführt und ein gleiches Volumen Chloroform zugegeben: Isoamylalkohol (24:1), der vollständig vibriert und mit 12.000 U/min Zentrifugation 10 Minuten lang gemischt wurde; (9) den Überstand in ein anderes steriles Zentrifugenröhrchen überführen; Zugabe des 2-fachen Volumens Ethanol, Volumenniveau Natriumacetat 1/10 schütteln, bis der flockige Niederschlag der DNA sichtbar ist; (10) Die Probe wird für 30 Minuten in einen Kühlschrank mit Gefrierfach bei -20 °C oder für 15 bis 20 Minuten in ein Eisbad gestellt und anschließend erneut 10 Minuten lang bei 12.000 U/min zentrifugiert, um die DNA auszufällen. (11) Der Pistolenkopf nimmt die DNA in ein anderes steriles Zentrifugenröhrchen auf, wäscht und schüttelt die Menge an 70 %igem Ethanol, um Verunreinigungen der DNA auszuwaschen. (12) Aus Ethanol, DNA durch Vakuumtrocknung oder natürliche Trocknung, Zugabe von TE-Puffer zur Auflösung, -20 °C im Standby-Modus gelagert.
2. UV-Spektrophotometer testen DNA-Reinheit von 260/280 nahe 1,8 (1,8 ± 0,05), die Konzentration beträgt 100 ng/μL oder mehr vor der nächsten Sequenzierung.
3. Die extrahierte genomische DNA wird an die Sangon Biology Engineering Limited Company (Shanghai) gesendet und sequenziert, um mögliche Mutationen im Zusammenhang mit der ADHS-Risikosequenz zu finden. Laut NIH-Gendatenbank das längste Transkript von NDRG2 (ID: 57447-Gen, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000014.9? Report=genbank&from=21016763&to=21070872&strand=true) (insgesamt (von 17 Exons und 16 Introns und der 5'-UTR- und 3'-UTR-Region des Gens) werden Sequenzen ausgerichtet, um mögliche Mutationen zu finden.
4. Verwendung der Chi-Quadrat-Analyse und anderer statistischer Methoden zur Bestimmung des Zusammenhangs zwischen den Mutationen und der Anfälligkeit für ADHS.