Screening del gene candidato per il disturbo da deficit di attenzione/iperattività (ADHD)

Fonte: banca campione dell'ospedale Xijing e dell'ospedale pediatrico affiliato alla Soochow University; Forma del campione: Sangue intero; Numero stimato di campioni: 100 pazienti con ADHD ed età, controlli sani abbinati al sesso; Criteri di esclusione dei casi: tutti i tipi di disturbi neuropsichiatrici, valore QI inferiore a 70;

Protocollo di studio:

1. Utilizzando il kit Qiagen per estrarre il DNA genomico di 200 microlitri di sangue. (1) sciogliere il sangue congelato a temperatura ambiente; (2) prelevare il sangue di 0,2 ml in una provetta da centrifuga sterile anticoagulante, aggiungere un volume uguale di tampone fosfato PBS, dopo aver miscelato completamente la centrifugazione a 12000 giri/min per 5 minuti, scartare il surnatante; (3) 66,7 L STE 2,4 L, 20% SDS, bagnomaria a 37°C 1 ora; (4) proteasi K più 1 miscela da 20 mg/ml per litro, digestione in bagno d'acqua a 55°C durante la notte (10 ~ 14 ore); (5) i campioni digeriti trattati con fenolo saturo Tris, agitare bene, centrifuga a 12000 giri/minuto per 10 minuti; (6) la fase acquosa superiore in una provetta da centrifuga sterile; aggiungendo volume di Tris fenolo saturo, agitare bene, centrifuga a 12000 giri/minuto per 10 minuti; (7) la fase acquosa superiore è stata trasferita in un'altra provetta da centrifuga sterile, ed è stato aggiunto un volume uguale di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25: 24: 1). L'oscillazione del vortice è stata completamente miscelata e il 12000rpm è stato centrifugato a 10 minuti; (8) la fase acquosa superiore è stata trasferita in un'altra provetta da centrifuga sterile ed è stato aggiunto un volume uguale di cloroformio: alcol isoamilico (24: 1), che è stato completamente vibrato e miscelato con centrifugazione a 12000 giri/min per 10 minuti; (9) trasferire il surnatante in un'altra provetta da centrifuga sterile; aggiungendo 2 volte il volume di etanolo, il livello di volume di acetato di sodio 1/10 agitare, fino alla precipitazione flocculante del DNA visibile; (10) il campione viene posto a -20 °C frigorifero congelatore 30 minuti o bagno di ghiaccio per 15 ~ 20 minuti, dopo la rimozione di 12000 giri/min centrifuga di nuovo 10 minuti, in modo che la precipitazione del DNA; (11) la testa della pistola raccoglierà il DNA in un altro tubo centrifugo sterile, con una quantità di lavaggio e agitazione di etanolo al 70%, per eliminare le impurità del DNA; (12) da etanolo, DNA mediante essiccazione sotto vuoto o essiccamento naturale, tampone TE aggiungendo dissoluzione, -20 conservato in standby.
2. Lo spettrofotometro UV testa la purezza del DNA di 260/280 vicino a 1,8 (1,8 ± 0,05), la concentrazione di 100 ng/μL o più prima del successivo sequenziamento.
3. Il DNA genomico estratto sarà inviato alla Sangon Biology Engineering Limited Company (Shanghai) e sequenziato per trovare mutazioni candidate correlate alla sequenza di rischio ADHD. Secondo il database del gene NIH, la trascrizione più lunga di NDRG2 (ID: 57447 ​​gene, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000014.9? Report=genbank&from=21016763&to=21070872&strand=true) (un totale di 17 esoni e 16 introni e la regione del gene 5'UTR e 3'UTR) saranno sequenze allineate per trovare potenziali mutazioni.
4. Utilizzando l'analisi del chi quadrato e altri metodi statistici per determinare la relazione tra le mutazioni e la suscettibilità all'ADHD.