Triagem de genes candidatos para transtorno de déficit de atenção/hiperatividade (TDAH)

Fonte: Banco de amostras do Hospital Xijing e do Hospital Infantil afiliado à Universidade de Soochow; Formulário de amostra: Sangue total; Número estimado de amostras: 100 pacientes com TDAH e controles saudáveis ​​pareados por idade e sexo; Critérios de exclusão de casos: todos os tipos de distúrbios neuropsiquiátricos, valor de QI inferior a 70;

Protocolo de estudo:

1. Usando o kit Qiagen para extrair o DNA genômico de 200 microlitros de sangue. (1) derreter sangue congelado à temperatura ambiente; (2) levar 0,2 ml de sangue para um tubo estéril de centrífuga anticoagulante, adicionar um volume igual de tampão fosfato PBS, depois de misturar completamente 12000rpm centrifugação 5min, descartar o sobrenadante; (3) 66,7 L STE 2,4 L, 20% SDS, 37 DEG C banho-maria 1h; (4) protease K mais 1 mistura de 20mg/ml l, digestão em banho-maria a 55°C durante a noite (10 ~ 14h); (5) as amostras digeridas tratadas com fenol saturado com Tris, agitar bem, centrífuga 12000rpm 10min; (6) a fase aquosa superior para um tubo de centrífuga estéril; adicionar volume de fenol saturado com Tris, agitar bem, centrífuga 12000rpm 10min; (7) a fase aquosa superior foi transferida para outro tubo de centrífuga estéril, e um volume igual de fenol foi adicionado: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1). A oscilação do vórtice foi totalmente misturada, e a 12000rpm foi centrifugada a 10min; (8) a fase aquosa superior foi transferida para outro tubo de centrífuga estéril, e igual volume de clorofórmio foi adicionado: álcool isoamílico (24:1), que foi totalmente vibrado e misturado com centrifugação 12000rpm 10min; (9) transferir o sobrenadante para outro tubo de centrífuga estéril; adicionando 2 vezes o volume de etanol, o nível de volume de agitação de acetato de sódio 1/10, até a precipitação floculenta de DNA visível; (10) a amostra é colocada a -20 DEG C geladeira freezer 30min ou banho de gelo por 15 ~ 20min, após a remoção de 12000rpm centrífuga 10min novamente, para que a precipitação do DNA; (11) a cabeça da pistola coletará DNA para outro tubo centrífugo estéril, com a quantidade de etanol 70% lavando e agitando, para lavar as impurezas do DNA; (12) de etanol, DNA por secagem a vácuo ou seco naturalmente, dissolução de adição de tampão TE, -20 armazenados em espera.
2. O espectrofotômetro UV testa a pureza do DNA de 260/280 próximo a 1,8 (1,8 ± 0,05), a concentração de 100 ng/μL ou mais antes do próximo sequenciamento.
3. O DNA genômico extraído será enviado para a Sangon Biology Engineering Limited Company (Shanghai) e sequenciado para encontrar mutações candidatas relacionadas à sequência de risco de TDAH. De acordo com o banco de dados de genes do NIH, a transcrição mais longa de NDRG2 (ID: gene 57447, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000014.9? Report=genbank&from=21016763&to=21070872&strand=true) (um total de 17 exons e 16 introns e o gene 5'UTR e 3'região UTR) serão sequencias alinhadas para encontrar potenciais mutações.
4. Usando a análise do qui-quadrado e outros métodos estatísticos para determinar a relação entre as mutações e a suscetibilidade ao TDAH.