Kandidaatgenscreening voor aandachtstekortstoornis/hyperactieve stoornis (ADHD)

Bron: Voorbeeldbank van het Xijing-ziekenhuis en het kinderziekenhuis dat is aangesloten bij de Soochow-universiteit; Monsterformulier: Volbloed; Geschat aantal monsters: 100 patiënten met ADHD en gezonde controles met leeftijd en geslacht; Uitsluitingscriteria: alle soorten neuropsychiatrische stoornissen, IQ-waarde van minder dan 70;

Leerprotocool:

1. Qiagen-kit gebruiken om het genomische DNA uit 200 microliter bloed te extraheren. (1) smelt bevroren bloed bij kamertemperatuur; (2) neem het bloed van 0,2 ml in een steriele antistollingscentrifugebuis, voeg een gelijk volume PBS-fosfaatbuffer toe, na volledig mengen van 12000 rpm centrifugatie gedurende 5 minuten, gooi supernatant weg; (3) 66,7 L STE 2,4 L, 20% SDS, 37°C waterbad 1 uur; (4) protease K plus 1 20mg/ml l mix, 55°C waterbaddigestie overnacht (10 ~ 14 uur); (5) de verteerde monsters behandeld met Tris verzadigde fenol, goed schudden, 12000 rpm centrifugaal 10 min; (6) de bovenste waterige fase naar een steriele centrifugebuis; volume Tris-verzadigd fenol toevoegen, goed schudden, 12000 tpm centrifugaal 10 min; (7) de bovenste waterige fase werd overgebracht naar een andere steriele centrifugebuis en een gelijk volume fenol werd toegevoegd: chloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1). De oscillatie van de vortex was volledig gemengd en de 12000 tpm werd gecentrifugeerd tot 10 minuten; (8) de bovenste waterige fase werd overgebracht naar een andere steriele centrifugebuis en een gelijk volume chloroform werd toegevoegd: iso-amylalcohol (24:1), dat volledig werd getrild en gemengd met 12000 rpm centrifugatie gedurende 10 minuten; (9) breng het supernatant over naar een andere steriele centrifugebuis; toevoeging van 2 keer volume ethanol, het volumeniveau van natriumacetaat 1/10 schudden, totdat de vlokvormige neerslag van DNA zichtbaar is; (10) het monster wordt geplaatst bij -20°C koelkast met vriesvak 30 min of ijsbad gedurende 15 ~ 20 min, na verwijdering van 12000 rpm centrifugaal 10 min opnieuw, zodat DNA-precipitatie; (11) de pistoolkop zal DNA naar een andere steriele centrifugaalbuis halen, met de hoeveelheid 70% ethanol wassen en schudden, om onzuiverheden-DNA uit te wassen; (12) uit ethanol, DNA door vacuümdrogen of op natuurlijke wijze drogen, TE-buffer die oplossing toevoegt, -20 opgeslagen in stand-by.
2. UV-spectrofotometertest DNA-zuiverheid van 260/280 dicht bij 1,8 (1,8 ± 0,05), de concentratie van 100 ng/μL of meer vóór de volgende sequencing.
3. Het geëxtraheerde genomische DNA zal naar Sangon Biology Engineering Limited Company (Shanghai) worden gestuurd en de sequentie wordt bepaald om kandidaat-mutaties te vinden die verband houden met de ADHD-risicosequentie. Volgens de NIH-genendatabase is het langste transcript van NDRG2 (ID: 57447-gen, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000014.9? Report=genbank&from=21016763&to=21070872&strand=true) (een totaal van 17 exons en 16 introns en het gen 5 'UTR en 3' UTR-gebied) zullen uitgelijnde sequenties zijn om potentiële mutaties te vinden.
4. Gebruik van de chi-kwadraatanalyse en andere statistische methoden om de relatie tussen de mutaties en vatbaarheid voor ADHD te bepalen.