Badanie przesiewowe genów kandydatów pod kątem zespołu nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi (ADHD)

Źródło: Przykładowy bank Szpitala Xijing i Szpitala Dziecięcego powiązanego z Uniwersytetem Soochow; Postać próbki: Krew pełna; Szacunkowa liczba próbek: 100 pacjentów z ADHD i wiekiem, dobrana pod względem płci zdrowa grupa kontrolna; Kryteria wykluczenia przypadku: wszystkie rodzaje zaburzeń neuropsychiatrycznych, wartość IQ poniżej 70;

Protokół badania:

1. Wykorzystanie zestawu Qiagen do ekstrakcji genomowego DNA z 200 mikrolitrów krwi. (1) stopić zamrożoną krew w temperaturze pokojowej; (2) pobrać 0,2 ml krwi do sterylnej antykoagulacyjnej probówki do wirówki, dodać równą objętość buforu fosforanowego PBS, po całkowitym wymieszaniu wirować przy 12000 obr./min przez 5 min, odrzucić supernatant; (3) 66,7 l STE 2,4 l, 20% SDS, łaźnia wodna 37°C 1 godz.; (4) proteaza K plus 1 20 mg/ml 1 mieszaniny, trawienie w łaźni wodnej w temperaturze 55°C przez noc (10 ~ 14 godzin); (5) strawione próbki traktowane nasyconym fenolem Tris, dobrze wstrząsnąć, wirowanie przy 12000 obr./min przez 10 min; (6) górna faza wodna do sterylnej probówki wirówkowej; dodanie objętości nasyconego fenolu Tris, dobrze wstrząsnąć, wirowanie 12000 obr./min 10 min; (7) górną fazę wodną przeniesiono do innej sterylnej probówki wirówkowej i dodano równą objętość fenolu: chloroformu: alkoholu izoamylowego (25:24:1). Oscylacja wiru była całkowicie wymieszana i wirowano przy 12000 obr./min przez 10 minut; (8) górną fazę wodną przeniesiono do innej sterylnej probówki do wirowania i dodano równą objętość chloroformu: alkoholu izoamylowego (24:1), który całkowicie wibrowano i mieszano z wirowaniem przy 12000 obr./min przez 10 minut; (9) przenieść supernatant do innej sterylnej probówki wirówkowej; dodając 2-krotność objętości etanolu, poziom objętości octanu sodu 1/10 wstrząsnąć, aż do widocznego kłaczkowatego wytrącania DNA; (10) próbkę umieszcza się w lodówce z zamrażarką -20 ° C na 30 minut lub w łaźni lodowej na 15 ~ 20 minut, po ponownym usunięciu wirówki z prędkością 12000 obr./min na 10 minut, aby wytrącić DNA; (11) głowica pistoletu pobierze DNA do innej sterylnej probówki wirówkowej, przemywając i wstrząsając ilością 70% etanolu, aby wypłukać zanieczyszczenia DNA; (12) z etanolu, DNA przez suszenie próżniowe lub suszenie naturalnie, rozpuszczanie buforu TE, -20 przechowywane w trybie gotowości.
2. Test spektrofotometrem UV Czystość DNA 260/280 bliska 1,8 (1,8 ± 0,05), stężenie 100 ng/μL lub więcej przed kolejnym sekwencjonowaniem.
3. Wyekstrahowany genomowy DNA zostanie wysłany do Sangon Biology Engineering Limited Company (Szanghaj) i zsekwencjonowany w celu znalezienia potencjalnych mutacji związanych z sekwencją ryzyka ADHD. Według bazy danych NIH, najdłuższy transkrypt genu NDRG2 (ID: 57447 ​​gen, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000014.9? Report=genbank&from=21016763&to=21070872&strand=true) (łącznie 17 eksonów i 16 intronów oraz region UTR 5 genu i 3 UTR) będą sekwencjami dopasowanymi w celu znalezienia potencjalnych mutacji.
4. Wykorzystanie analizy chi-kwadrat i innych metod statystycznych do określenia związku między mutacjami a podatnością na ADHD.