Ehdokasgeeniseulonta tarkkaavaisuus-/hyperaktiivisen häiriön (ADHD) varalta

Lähde: Xijingin sairaalan näytepankki ja Soochowin yliopistoon sidoksissa oleva lastensairaala; Näytelomake: Kokoveri; Arvioitu näytteiden määrä: 100 ADHD-potilasta ja ikää, sukupuolta vastaava terveet kontrollit; Tapauksen poissulkemiskriteerit: kaikenlaiset neuropsykiatriset häiriöt, IQ-arvo alle 70;

Tutkimusprotokolla:

1. Qiagen-sarjan käyttö 200 mikrolitran verta genomisen DNA:n erottamiseen. (1) sulattaa jäätynyttä verta huoneenlämpötilassa; (2) ota 0,2 ml:n verta steriiliin antikoagulaatiosentrifugiputkeen, lisää yhtä suuri määrä PBS-fosfaattipuskuria, kun olet sekoittunut täysin 12 000 rpm:n sentrifugoinnilla 5 minuuttia, hävitä supernatantti; (3) 66,7 1 STE 2,4 1, 20 % SDS, 37 °C vesihaude 1 h; (4) proteaasi K plus 1 20 mg/ml l-seos, 55 °C:n vesihauteen digestio yön yli (10 - 14 tuntia); (5) digestoidut näytteet käsiteltiin Trisillä kyllästetyllä fenolilla, ravistetaan hyvin, 12000 rpm keskipako 10 min; (6) ylempi vesifaasi steriiliin sentrifugiputkeen; lisäämällä tilavuus Tris-kyllästettyä fenolia, ravista hyvin, 12000 rpm keskipako 10 min; (7) ylempi vesifaasi siirrettiin toiseen steriiliin sentrifugiputkeen ja lisättiin yhtä suuri tilavuus fenolia: kloroformi:isoamyylialkoholi (25:24:1). Pyörteen värähtely sekoitettiin täysin ja 12 000 rpm sentrifugoitiin 10 minuuttiin; (8) ylempi vesifaasi siirrettiin toiseen steriiliin sentrifugiputkeen ja lisättiin yhtä suuri tilavuus kloroformia: isoamyylialkoholia (24:1), jota värähteltiin täysin ja sekoitettiin 12 000 rpm sentrifugoinnilla 10 min; (9) siirrä supernatantti toiseen steriiliin sentrifugiputkeen; lisätään 2-kertainen tilavuus etanolia, natriumasetaatin tilavuustaso 1/10 ravistetaan, kunnes DNA:n flokkuloiva saostuminen näkyy; (10) näyte asetetaan -20 °C:seen jääkaappipakastimeen 30 minuutiksi tai jäähauteeseen 15 - 20 minuutiksi, 12 000 rpm:n keskipakokaasun poistamisen jälkeen 10 minuutiksi uudelleen, jotta DNA saostuu; (11) pistoolin pää poimii DNA:ta toiseen steriiliin keskipakoputkeen, jossa on 70 % etanolia, huuhtelee pois epäpuhtaudet DNA:sta; (12) pois etanolista, DNA tyhjökuivaamalla tai kuivaa luonnollisesti, TE-puskuri lisää liukenemista, -20 °C säilytetty valmiustilassa.
2. UV-spektrofotometritesti DNA:n puhtaus 260/280 lähellä 1,8 (1,8 ± 0,05), pitoisuus 100 ng/μL tai enemmän ennen seuraavaa sekvensointia.
3. Uutettu genominen DNA lähetetään Sangon Biology Engineering Limited Companylle (Shanghai) ja sekvensoidaan ADHD-riskisekvenssiin liittyvien ehdokasmutaatioiden löytämiseksi. NIH-geenitietokannan mukaan NDRG2:n pisin transkriptio (ID: 57447 ​​geeni, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000014.9? Report=genbank&from=21016763&to=21070872&strand=true) 17 eksonista ja 16 intronista ja geenin 5 'UTR- ja 3' UTR-alue) rinnastetaan sekvenssien mahdollisten mutaatioiden löytämiseksi.
4. Käyttämällä chi square -analyysiä ja muita tilastollisia menetelmiä mutaatioiden ja ADHD-alttiuden välisen suhteen määrittämiseksi.