Microchimerismo materno nei linfonodi dei neonati con atresia biliare al momento dell'operazione di Kasai (K-LNMC)

All'intervento di neonati con atresia biliare non sindromatica (BA, forma più comune), i chirurghi notano quasi invariabilmente il riscontro prominente di linfonodi multipli ingrossati fino a 2 cm di dimensione nella porta epatica e nel mesentere dell'intestino tenue dove possono costituire uva come i complessi. I neonati della stessa età laparotomizzati per altre patologie comunemente non presentano tali linfonodi.

L'atresia biliare è una malattia del neonato che è fatale se non trattata. Istologicamente corrisponde ad una degenerazione delle vie biliari intra ed extra epatiche all'interno di un infiltrato infiammatorio in parte specifico e cirrosi progressiva.

L'eziologia di questa malattia rara ma costante (1:8-1:15.000) è sconosciuta. Attualmente nella ricerca sull'eziologia BA vengono perseguite due strade principali:

1. Si sospettano processi (auto)immuni perinatali indotti da virus. Una forma sperimentale di BA può essere provocata infettando madri murine con virus dsRNA, ad es. Rhesus-rotavirus o Reo-virus mentre nei topi, la vaccinazione delle madri ha impedito la BA sperimentale. L'importanza del pathway γ/δ-cellule T e IL17/IL 23 per BA è attualmente indagata. Tuttavia, in gruppi di animali singenici trattati dallo stesso lotto di virus, BA tende ad essere incostante ed è limitato ai dotti biliari extraepatici, ad esempio circa la validità del modello animale è un problema.
2. L'altra direzione della ricerca non si basa principalmente su esperimenti che coinvolgono animali appena nati: ci sono indicazioni che durante la gravidanza la barriera placentare può diventare permeabile per i linfociti materni (ad es. 2008 linfociti materni sono stati dimostrati nel fegato di neonati BA. Successivamente il fenomeno del microchimerismo materno-fetale è stato messo al centro della ricerca sull'eziologia della BA: nel contesto delle reazioni immunitarie materno-fetali miste, le cellule di origine materna potrebbero indirizzare erroneamente il sistema immunitario immaturo del bambino verso l'autoimmunità o agire direttamente come effettori nella un innesto contro un ospite come la moda.

Recentemente è stata segnalata l'importanza dei linfonodi mesenterici e portali per la maturazione del sistema immunitario durante la gravidanza. Inoltre è stato dimostrato che il flusso tra fegato e linfonodi portali è bidirezionale. Nei topi la frequenza delle cellule T regolatorie CD4+ e FoxP3+ è risultata collegata allo stato immunitario della madre. Abbiamo quindi ipotizzato che i linfonodi prominenti ingrossati dei neonati BA che i chirurghi incontrano costantemente durante l'operazione di Kasai possano essere una chiave per una migliore comprensione dei meccanismi fisiopatologici di traffico di linfociti importanti.

Nell'operazione standard, l'operazione Kasai che in una razza con cirrosi epatica in aumento ha senso fino all'età di 4 mesi, vengono asportati i resti degradati dei principali dotti biliari nell'ilo epatico (la cosiddetta "placca ilare") , Un'ansa a Y di Roux viene suturata sul sito di resezione. Drena qualsiasi flusso biliare contingente dai restanti dotti biliari. Il tasso di successo a lungo termine di questo tentativo di cura chirurgica che è di moderata complessità tecnica e invasività è stimato a ca. 15-20%. Nel resto un successo parziale può rimandare la necessità del trapianto di fegato. Abbiamo esaminato in sette pazienti consecutivi con atresia biliare istologicamente provata se nei linfonodi periportali vi fosse evidenza di materiale gentico materno.

Metodi :

Sono stati inclusi nello studio 7 pazienti consecutivi con diagnosi preoperatoria di BA. Altre cause di ittero prolungato (deficit di α1 anti-tripsina, sindrome di Alagilles, PFIC ecc.) erano state escluse tra i metodi ERCP di successo tecnico (5/7 pazienti) che mostravano l'assenza di dotti biliari intraepatici.

Dopo aver ottenuto il consenso informato dei genitori, sono stati prelevati 2 ml di sangue intero EDTA dalla madre e dal neonato. Durante l'operazione di Kasai sono stati prelevati campioni di un linfonodo portale e di un linfonodo mesenterico (voto del comitato etico della Scuola di medicina di Hannover n. 1650/12.11.2012. Dopo la dissezione bipolare gli spazi mesenterici sono stati chiusi con suture Vicryl 4-0.

I linfonodi sono stati distrutti meccanicamente e il DNA è stato estratto enzimaticamente (QIAmp Kit, Qiagen, Hilden/Germany) come descritto in precedenza e normalizzato a 30 ug/ml.

L'analisi di ripetizione tandem breve è stata realizzata con PCR multiplex per i marcatori LIPOL, VWA, TH01, D19S253, CSF, PLA2A. FGA, D21S11, D18S51 come descritto. In breve, l'analisi della lunghezza dei frammenti è stata eseguita su un sistema Abi Prism 310 con GeneScan 3.11. software per il confronto del sangue della madre e del bambino con il DNA dei linfonodi.

I polimorfismi genetici a singolo nucleotide (SNP) sono stati tracciati mediante analisi quantitative del chimerismo PCR in tempo reale. Le reazioni sono state eseguite su una piattaforma PCR in tempo reale iCycler iQ5 (Bio-Rad) utilizzando ABsolute QPCR Rox Mix (Thermo scientific). Primer e sonde progettati su misura sono stati forniti da Sigma-Aldrich. Le reazioni di controllo e la normalizzazione del DNA del campione sono state eseguite amplificando il gene dell'albumina.