Condizioni cliniche e prevalenza di parodontopatogeni in fumatori e non fumatori dopo terapia parodontale

Sessanta pazienti (30 fumatori (SM) e 30 non fumatori (NS) saranno selezionati per partecipare a questo studio. Tutti i soggetti saranno reclutati dal Dipartimento di Parodontologia, Scuola di Odontoiatria, Università Federale Fluminense, Nova Friburgo, Stato di Rio de Janeiro, Brasile. Il protocollo di studio è stato approvato (numero di protocollo: CAAE - 0070.0.258.000-10) dal Comitato Etico della Facoltà di Medicina dell'Università Federale Fluminense. Prima della partecipazione, lo scopo e le procedure saranno completamente spiegati a tutti i pazienti, che di conseguenza hanno dato il consenso informato scritto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. Verranno raccolte anamnesi mediche e dentistiche e i pazienti riceveranno una valutazione clinica durante le visite di pre-screening.

Esame clinico, raccolte microbiologiche e terapia parodontale Verranno registrati i precedenti esami clinici, le informazioni sugli anni di consumo di sigari e la quantità di consumo giornaliero per selezionare i soggetti fumatori e non fumatori per lo studio. Un parodontologo esperto eseguirà i parametri parodontali clinici nei denti per la procedura del protocollo. Ogni dente selezionato selezionato verrà misurato per: Indice di placca (PI), Sanguinamento alla sonda (BOP), Profondità di sondaggio della tasca (PPD), Recessione gengivale (GR), Livello di attaccamento clinico (CAL) utilizzando una sonda parodontale PCP15 (PCP-UNC15 , Hu-Friedy, Chicago, IL), saranno registrati sei siti (mesio-buccale, mediobuccale, disto-buccale, mesio-linguale, medio-linguale, disto-linguale). I siti con profondità di sondaggio (PPD) > 5 mm saranno selezionati per l'analisi microbiologica. Dopo le misurazioni cliniche, il biofilm sopragengivale verrà rimosso con garza sterile. I campioni crevicolari gengivali verranno prelevati da 4 siti con il PPD più profondo (> 5 mm) in ciascun paziente utilizzando una punta di carta sterile dalla tasca più profonda per 30 secondi. I biofilm raggruppati da ciascun sito saranno separati in due microtubi contenenti tampone Tris-EDTA (10 mM Tris-Hcl, 0.1 mM EDTA, pH 7.5) e conservati a -20°C. I campioni saranno analizzati microbiologicamente mediante Polymerase Chain Reaction - PCR. Il trattamento parodontale consisterà nel ridimensionamento e nella pianificazione della radice, 4 volte nel primo mese e successivamente una volta al mese fino al completamento di 1 anno. I pazienti saranno valutati clinicamente e verranno effettuate raccolte microbiologiche al basale, 3 mesi, 6 mesi e 1 anno dopo il trattamento parodontale.

Valutazione microbiologica - Saggi PCR Il DNA sarà estratto e quantificato in uno spettrofotometro a 260 nm (Genesys 10UV, Rochester, NY, USA), al fine di ottenere una concentrazione standard di 100 ng/mL e conservato a -20 °C per la successiva PCR reazioni. In breve, i campioni saranno sottoposti ad una soluzione lisante (tampone di estrazione e proteinasi K) e quindi purificati usando cloroformio:isoamil-alcool, seguita da precipitazione del DNA con isopropanolo e etanolo al 70%. Il DNA sarà risospeso in tampone TE (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.5, con 10 μg/mL RNAse). L'identificazione molecolare microbica sarà effettuata mediante PCR con primers specifici per Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Prevotella intermedia, Campylobacter rectus, Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis e Candida dublinienses. L'amplificazione PCR sarà eseguita con un sistema GeneAmp PCR 2400 (Perkin-Elmer - Applied Biosystems) per TGradient 96 (Biometra, Germania) in condizioni termiche specifiche per ciascuna coppia di primer. I prodotti della PCR saranno separati mediante elettroforesi in gel di agarosio al 2% e tampone di corsa Tris-borato-EDTA (pH 8.0). La scala di massa molecolare (100 bp DNA ladder, Gibco, Grand Island, NY, USA) sarà inclusa per l'esecuzione nel gel di agarosio. Il DNA sarà colorato con 0.1µl di Sybr Safe/mL (Invitrogen, CA, USA) e visualizzato sotto illuminazione UV (Pharmacia LKB-MacroVue, San Gabriel, CA, USA). Verranno scattate fotografie delle immagini (Image Mater - LISCAP, VDS, Pharmacia Biotech Piscataway, NJ, USA) e analizzate.